LightYagamii: Laporan MikroBiologi Modul II

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Untuk menelaah bakteri dan jamur di laboratorium, kita harus dapat menumbuhkan atau mengembangkan bakteri dan jamur tersebut. Adanya pembiakan bakteri dan jamur dimaksudkan untuk memudahkan pemeriksaan yang akan dilakukan di dalam laboratorium, sehingga jika sewaktu-waktu kita memerlukan bakteri dan jamur untuk suatu percobaan, maka bakteri dan jamur tersebut telah tersedia. Biakkan bakteri dan jamur tersebut dapat disimpan di dalam lemari es untuk waktu yang lama tanpa ada kerusakan.

Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan kompleks. Ratusan spesies mikroba menghuni bagian tubuh kita, seperti mulut, saluran pencernaan dan kulit. Udara, tanah, dan air yang merupakan komponen alam sebagai tempat tinggal kita juga dihuni oleh beragam mikroorganisme. Campuran mikroba tersebut dapat dipisahkan dengan tehnik isolasi. Isolasi mikroba berarti memisahkan satu jenis mikroba dari biakan campuran menjadi satu biakan murni (populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk) (Hadioetomo, 1985).

Medium adalah bahan yang terdiri dari campuran zat-zat untuk menambahkan mikroba. Selain itu juga berguna untuk isolasi sifat-sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba dalam suatu bahan. Begitu tersedia kodisi yang memuaskan untuk kultivasi, maka reproduksi dan pertumbuhan bakteri dapat diamati dan diukur, untuk menentukan pengaruh berbagai kondisi baik terhadap reproduksi dan pertumbuhan bakteri tersebut, dan untuk menentukan perubahan-perubahan apa saja yang dihasilkan oleh bakteri di dalam lingkngan tumbuhnya (Volk, 1988).
Mikrobiologi adalah satu ilmu yang mempelajari kehidupan dan mikroba organisme hidup yang berukuran mikro atau sangat renik. Mikroorganisme ini sangaterat kaitannya denga kehidupan, baik yang bermanfaat atau merugikan makhluk hidup yang lainnya. Ada diantara mereka yang hidup dalam media agar yang dapat menyebabkan penyakit ataupun menguntungkan misalnya dalam proses pembutan anggur, keju, yogurt, produksi penisilin dan proses pembuangan limbah (Irianto, 2006).
Untuk menelaah bakteri di laboratorium kita harus dapat menumbuhkan bakteri dalam biakan murni.Untuk melakukan hal itu, haruslah mengerti jenis-jenis nutrient yang disyaratkan oleh bakteri dan juga macam lingkngan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhannya. Dalam pembuatan medium harus ada beberapa persyaratan yang harus dipenuhi yaitu sebagai berikut :

1. Mengandung semua zat yang mudah digunakan oleh mikroba.

2. Tidak mengandung zat penghambat pertmubuhan.

3. Mempunyai tekanan osmose dan tekanan muka.

4. Mempunyai derajat keasaman (pH) yang sesuai.

5. Dan dalam keadaan steril.

Medium dapat dibedakan menjadi 3 macam, yaitu :

1. Berdasarkan susunan kimianya, yaitu medium organic, medium anorganik, medium sintetik dan medium non sintetik.

2. Berdasarkan konsistensi medium yaitu medium cair, padat dan semi padat.

3. Berdasarkan fungsi yaitu diperkaya, spesifik, perhitungan penguji dan khusus.

Dalam pembuatan media agar ini, dilakukan dengan pembuatan Media agar OF, Media agar TS, Media agar MR, Media agar TSI, dan Media uji agar indole, yang telah disiapkan dan diseterilkan. Setelah disterilkan semua media tersebut didapatkan berbagai warna, seperti : Media agar OF berwarna hijau, Media agarTS berwarna kuning, Media agar MR berwarna kuning keruh, Media agar TSI kuning gelap, Media agar uji indole berwarna kuning bening. Tidak ada satupun perangkat kondisi yang memuaskan kultivasi semua bakteri di laboratorium. Bakteri amat beragam baik dalam persyaratan nutrisi maupun fisiknya. Beberapa bakteri mempunyai persyaratan nutrient yang sederhana, sedangkan yang lain mempunyai persyaratan yang rumit. Beberapa spesies tumbuh pada suhu serendah 0 ⁰C, sedangkan yang lain tumbuh pada suhu 75 ⁰C. Beberapa membutuhkan oksigen bebas,sedangkan yang lain dihambat oleh oksigen. Karena alasan ini, maka kondisi harus disesuaikan sedemikian sehingga menguntungkan bagi kelompok bakteri tertentu yang sedang ditelaah (Dwidjoseputro, 2005).

1.2. Tujuan

Tujuan praktikum mikrobiologi kali ini yaitu :

a. Praktikan memahami bermacam-macam teknik sterilisasi.

b. Praktikan dapat mengoperasikan alat-alat sterilisasi.

c. Praktikan memahami mengenai bermacam-macam media.

d. Praktikan dapat membuat media.

e. Praktikan memahami bermacam-macam teknik pewarnaan.

f. Praktikan dapat melakukan gram dan pewarnaan spora.

1.3. Manfaat

Manfaat dari praktikum mikrobiologi kali ini yaitu :

1. Praktikan dapat mengetahui teknik sterilisasi dan alat-alat sterilisasi

2. Praktikan dapat mengetahui macam media dan membuat media

3. Praktikan dapat mengetahui teknik pewarnaan gram dan pewarnaan spora

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Pengertian Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu proses dimana kegiatan ini bertujuan untuk membebaskan alat ataupun bahan dari berbagai macam mikroorganisme. Suatu bahan bisa dikatakan steril apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen maupun tidak baik dalam bentuk vegetatip walaupun bentuk non vegetatif (spora) (Hadioetomo, 1993).

Sterilisasi merupakan salah satu faktor utama dalam fermentasi. Kita tentu mengharapkan tidak terjadi kontaminasi di mana mikroorganisme yang tidak diinginkan tumbuh dan mengganggu proses fermentasi. Teknik sterilisasi berbeda-beda tergantung pada jenis material. Bagian pertama akan menjelaskan secara singkat dan sederhana bagaiman sterilisasi cairan dan padatan (Pelczar, 1986).

Sterilisasi dalam mikrobiologi meruapakan proses penghilangan semua jenis organisme hidup.Dalam hal ini adalah mikroorganisme yang terdapat pada suatu benda. Menurut Koesmadji (2002), tujuan utama yaitu mematikan, menyingkirkan atau mengahmbat pertumbuhan mikroorganisme adalah :

1. Untuk mencegah inflasi pada manusia, hewan dan tumbuhan.

2. Untuk mencegah makanan dan lain-lain menjadi rusak.

3. Untuk mencegah gangguan kontaminasi terhadap mikroorganisme.

4. Untuk mencegah kontaminasi bahan-bahan yang dipakai

Sterilisasi adalah setiap proses kimia, fisika dan mekanik yang membunuh semua bentuk kehidupan terutama mikroorganisme (Madigan, 2010).
Sterilisasi adalah metode praktis yang dirancang untuk membersihkan dari mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya yang nyata dari kepentingan dasar di banyak keadaan. Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jenis pada alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi dan bakteri / virus dari lingkungan sekitar (Irianto ,2006).

Jenis dari mikroorganisme sangat berbeda dalam kelemahannya terdapat berbagai macam agen antimikroba, dan lebih banyak lagi, efek yang praktis dari agen ini pada adanya keadaan nyata yang sangat besar dipengaruhi oleh keadaan sekitar. Banyak yang akan bertahan, contohnya pada cuaca tertentu organisme kulit. Hal ini tidak mungkin, bagaimanapun pada garis besarnya tentunya prisip dasar digaris bawahi pada umumnya digunakan cara untuk memusnahkan dan mengontrol kehidupan mikroba (Burdon, 1969).

Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hastowo, 1992).

Cara kerja sterilisasi adalah cara kerja agar terhindar dari kontaminasi, cara kerja steril ini digunakan pada pembuatan media, pemeriksaan kultur dan pembuatan preparat. Cara-cara sterilisasi adalah sebagai berikut :

Secara fisis pemanasan basah
Secara mekanis dengan penyaringan
Secara fisis pemanasan kering
Secara kimia
Teknik aseptik

2.2. Macam-macam Teknik Sterilisasi

Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu panas, penyaringan, radiasi, dan penambahan bahan kimia. Sedangkan sterilisasi dengan cara panas dapat dilakukan dengan panas basah, panas kering, pemanasan bertahap dan perebusan.

a. Pemanasan

· Pemanasan basah

Pemanasan basah adalah sterilisasi panas yang digunakan bersama-sama dengan uap air. Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau aterilisator uap yang mudah diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121⁰C selama 15 menit (Hadioetomo, 1985). Cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mikroorganisme terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim didalam sel (Fardiaz, 1992).

· Pemanasan kering

Dibandingkan pemanasan basah, pemanasan kering kurang efisien dan membutuhkan suhu yang lebih tinggi serta waktu lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa kelembaban maka tidak ada panas laten (Hadioetomo, 1985). Pemanasan kering dapat menyebabkan dehidrasi sel dan oksidasi komponen-komponen di dalam sel (Fardiaz, 1992). Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan, selain itu peralatan yang digunakan untuk sterilisasi uap kering lebih murah dibandingkan uap basah (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan kering sering dilakukan dalam sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium, dimana menggunakan oven dengan suhu 160-180⁰C selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis (Fardiaz, 1992).

· Pemanasan bertahap

Pemanasan bertahap dilakukan bila media atau bahan kimia tahan terhadap uap 100⁰C (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan bertahap (tindalisasi) dilakukan dengan cara memanaskan medium atau larutan menggunakan uap selama satu jam setiap hari untuk tiga hari berturut-turut. Waktu inkubasi diantara dua proses pemanasan sengaja diadakan supaya spora dapat bergerminasi menjadi sel vegetatif sehingga mudah dibunuh pada pemanasan berikutnya (Fardiaz, 1992).

· Perebusan

Perebusan adalah pemanasan di dalam air mendidih atau uap air pada suhu 100⁰C selama beberapa menit (Fardiaz,1992). Pada suhu ini sel vegetatif dimatikan, sedang spora belum dapat dihilangkan (Lay dan Hastowo, 1992). Beberapa bakteri tertentu tahan terhadap suhu perebusan ini, misalnya Clostridium perfringens dan Clostridium botulinum tetap hidup meskipun direbus selama beberapa jam (Lay dan Hastowo, 1992).

b. Penyaringan

Penyaringan adalah proses sterilisasi yang dilakukan pada suhu kamar. Sterilisasi dengan penyaringan digunakan untuk bahan yang peka terhadap panas misalnya serum, urea dan enzim (Lay dan Hastowo, 1992). Dengan cara penyaringan larutan atau suspensi dibebaskan dari semua organisme hidup dengan cara melakukannya lewat saringan dengan ukuran pori yang sedemikian kecilnya sehingga bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan filtratnya ditampung didalam wadah yang steril (Hadioetomo, 1985).

c. Radiasi

· Radiasi Ionisasi

Radiasi ionisasi adalah radiasi yang mengandung energi yang jauh lebih tinggi daripada sinar ultraviolet. Oleh karena itu mempunyai daya desinfektan yang lebih kuat. Salah satu contoh radiasi ionisasi adalah sinar gamma yang dipancarkan dari kobalt-10 (Fardiaz, 1992). Radiasi dengan sinar gama dapat menyebabkan ion bersifat hiperaktif (Lay dan Hastowo, 1992).

· Radiasi Sinar Ultra Violet

Sinar ultra violet dengan panjang gelombang yang pendek memiliki daya antimikrobial yang sangat kuat. Daya kerjanya adalah absorbsi oleh asam nukleat tanpa menyebabkan kerusakan pada permukaan sel. Kerusakan tersebut dapat diperbaiki bila disinari dengan berkas yang mempunyai gelombang yang lebih panjang (Lay dan Hastowo, 1992).

d. Penambahan bahan kimia

Menurut Lay dan Hastowo (1992), bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu yang tinggi dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan gas. Bahan kimia yang sering digunakan antara lain :

1) Alkohol, daya kerjanya adalah mengkoagulasi protein. Cairan alkohol yang umum digunakan berkonsentrasi 70-80% karena konsentrasi yang lebih tinggi atau lebih rendah kurang efektif.

2) Khlor, Gas khlor dengan air akan menghasilkan ion hipokloride yang akan mengkoagulasikan protein sehingga membran sel rusak dan terjadi inaktivasi enzim.

3) Yodium, daya kerjanya adalah bereaksi dengan tyrosin, suatu asam amino dalam emzim atau protein mikroorganisme.

4) Formaldehida 8% merupakan konsentrasi yang cukup ampuh untuk mematikan sebagian besar mikroorganisme. Daya kerjanya adalah berkaitan dengan amino dalam protein mikrobia.

5) Gas etilen oksida, gas ini digunakan terutama untuk mensterilkan bahan yang dibuat dari plastik.

Sterilisasi dengan bahan kimia digunakan alkohol 70%. Menurut Koesmadji (2002), etil alkohol sangan efektif pada kadar 70% daripada 100% dan ini tidak membunuh spora. Sterilisasi dengan alkohol dilakukan pada proses pembuatan kultur stok dan teknik isolasi. Alkohol 70% disemprotkan pada tangan praktikan dan alat-alat seperti makropipet dan mikropipet. Alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri. Menurut Ali (2005), alkohol 70% dapat menyebabkan denaturasi protein dan koagulasi.

2.3. Alat-alat Sterilisasi

Macam macam alat sterilisasi yang biasa kita pakai di laboratorium mikrobiologi yaitu :

a. Autoklaf

Alat ini terdiri dari suatu tempat yang tahan terhadap tekanan tinggi yang dilengkapi dengan barometer termometer dan kleb. Cara menggunakan autoklaf isilah tempat air dengan air sampai angsang kemudian dimasukan alat atau bahan ke dalam otoklaf. Atur kran pengatur tempat keluar air ditutup sehingga tekanan uap di dalam autoklaf mencapai 2 atm dan suhu 121º dan biarkan sterilisasi berlangsung 15-30 menit. Untuk sediaan obat steril yang volumenya kurang dari 100 ml dilakukan sterilisasi 115º-116º selama 30 menit sedangkan untuk sediaan yang volumenya lebih dari 100 ml dilakukan sterilisasi dilakukan sampai seluruh isi berada dalam suhu 115º-116º dengan waktu 30 menit. Setelah sterilisasi selesai biarkan autoklaf sampai dingin sampai tekanan menunjukan angka 0 kemudian kran pengatur dibuka dan terakhir tutup bejana dibuka. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut. Endospora dapat dibunuh pada suhu 100 °C, yang merupakan titik didih air pada tekanan atmosfer normal. Pada suhu 121 °C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4-5 menit, dimana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6-30 detik pada suhu 65 °C. Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai 121 °C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 °C untuk waktu 10-15 menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu sterilisasi Performa autoklaf diuji dengan indicator biologi, contohnya Bacillus stearothermophilus (Baird, 2000).

Menurut Neidleman (1993), terdapat tiga jenis autoklaf, yaitu gravity displacement, prevacuum atau high vacuum, dan steam-flush pressure-pulse. Perbedaan ketiga jenis autoklaf ini terletak pada bagaimana udara dihilangkan dari dalam autoklaf selama proses sterilisasi.

1. Gravity Displacement Autoclave

Udara dalam ruang autoklaf dipindahkan hanya berdasarkan gravitasi. Prinsipnya adalah memanfaatkan keringanan uap dibandingkan dengan udara, sehingga udara terletak di bawah uap. Cara kerjanya dimulai dengan memasukan uap melalui bagian atas autoklaf sehingga udara tertekan ke bawah. Secara perlahan, uap mulai semakin banyak sehingga menekan udara semakin turun dan keluar melalui saluran di bagian bawah autoklaf, selanjutnya suhu meningkat dan terjadi sterilisasi. Autoklaf ini dapat bekerja dengan cakupan suhu antara 121-134 °C dengan waktu 10-30 menit.

2. Prevacuum atau High Vacuum Autoclave

Autoklaf ini dilengkapi pompa yang mengevakuasi hampir semua udara dari dalam autoklaf. Cara kerjanya dimulai dengan pengeluaran udara. Proses ini berlangsung selama 8-10 menit. Ketika keadaan vakum tercipta, uap dimasukkan ke dalam autoklaf. Akibat kevakuman udara, uap segera berhubungan dengan seluruh permukaan benda, kemudian terjadi peningkatan suhu sehingga proses sterilisasi berlangsung. Autoklaf ini bekerja dengan suhu 132-135 °C dengan waktu 3-4 menit.

3. Steam-Flush Pressure-Pulse Autoclave

Autoklaf ini menggunakan aliran uap dan dorongan tekanan di atas tekanan atmosfer dengan rangkaian berulang. Waktu siklus pada autoklaf ini tergantung pada benda yang disterilisasi.

b. Inkubator

Inkubator adalah alat yang digunakan untuk menginkubasi atau memeram mikroba pada suhu yang terkontrol. Alat ini dilengkapi dengan pengatur suhu dan pengatur waktu. Kisaran suhu untuk inkubator produksi Heraeus B5042 misalnya adalah 10-70 ⁰C. Inkubator secara umum digunakan sebagai perlengkapan dalam laboratorium mikrobiologi pangan. Inkubator memiliki fungsi yang sama dengan water bath yaitu sebagai alat inkubasi pada analisa mikrobiologi. Inkubator adalah alat yang digunakan untuk menciptakan suhu stabil dan konstan. Suhu inkbator dipengaruhi oleh adanya perubahan suhu pada suhu ruang, oleh karena itu perubahan suhu ruang perlu diawasi terutama saat terjadi perubahan musim (Neidleman, 1993).

c. Bunsen

Pembakar Bunsen (Bunsen Burner) Salah satu alat yang berfungsi untuk menciptakan kondisi yang steril adalah pembakar bunsen. Untuk sterilisasi jarum ose atau yang lain, bagian api yang paling cocok untuk memijarkannya adalah bagian api yang berwarna biru (paling panas). Perubahan bunsen dapat menggunakan bahan bakar gas atau metanol (Koesmadji, 2002).

d. Desinfektan

Desinfektan didefinisikan sebagai bahan kimia atau pengaruh fisika yang digunakan untuk mencegah terjadinya infeksi atau pencemaran jasad renik seperti bakteri dan virus, juga untuk membunuh atau menurunkan jumlah mikroorganisme atau kuman penyakit lainnya. Sedangkan antiseptik didefinisikan sebagai bahan kimia yang dapat menghambat atau membunuh pertumbuhan jasad renik seperti bakteri, jamur dan lain-lain pada jaringan hidup. Bahan desinfektan dapat digunakan untuk proses desinfeksi tangan, lantai, ruangan, peralatan dan pakaian.

Pada dasarnya ada persamaan jenis bahan kimia yang digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan. Tetapi tidak semua bahan desinfektan adalah bahan antiseptik karena adanya batasan dalam penggunaan antiseptik. Antiseptik tersebut harus memiliki sifat tidak merusak jaringan tubuh atau tidak bersifat keras. Terkadang penambahan bahan desinfektan juga dijadikan sebagai salah satu cara dalam proses sterilisasi, yaitu proses pembebasan kuman. Tetapi pada kenyataannya tidak semua bahan desinfektan dapat berfungsi sebagai bahan dalam proses sterilisasi.

Bahan kimia tertentu merupakan zat aktif dalam proses desinfeksi dan sangat menentukan efektivitas dan fungsi serta target mikroorganime yang akan dimatikan. Dalam proses desinfeksi sebenarnya dikenal dua cara, cara fisik (pemanasan) dan cara kimia (penambahan bahan kimia). Dalam tulisan ini hanya difokuskan kepada cara kimia, khususnya jenis-jenis bahan kimia yang digunakan serta aplikasinya. Banyak bahan kimia yang dapat berfungsi sebagai desinfektan, tetapi umumnya dikelompokkan ke dalam golongan aldehid atau golongan pereduksi, yaitu bahan kimia yang mengandung gugus -COH; golongan alkohol, yaitu senyawa kimia yang mengandung gugus -OH; golongan halogen atau senyawa terhalogenasi, yaitu senyawa kimia golongan halogen atau yang mengandung gugus -X; golongan fenol dan fenol terhalogenasi, golongan garam amonium kuarterner, golongan pengoksidasi, dan golongan biguanida.

Telah dilakukan perbandingan koefisien fenol turunan aldehid (formalin dan glutaraldehid) dan halogen (iodium dan hipoklorit) terhadap mikroorganisme Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi yang resisten terhadap ampisilin dengan tujuan untuk mengetahui keefektifan dari disinfektan turunan aldehid dan halogen yang dibandingkan dengan fenol dengan metode uji koefisien fenol . Fenol digunakan sebagai kontrol positif, aquadest sebagai kontrol negatif dan larutan aldehid dan halogen dalam pengenceran 1:100 sampai 1:500 dicampur dengan suspensi bakteri Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi resisten ampisilin yang telah diinokulum, keburaman pada tabung pengenceran menandakan bakteri masih dapat tumbuh. Nilai koefisien fenol dihitung dengan cara membandingkan aktivitas suatu larutan fenol dengan pengenceran tertentu yang sedang diuji. Hasil dari uji koefisien fenol menunjukan bahwa disinfektan turunan aldehid dan halogen lebih efektif membunuh bakteri Staphylococcus aureus dengan nilai koefisien fenol 3,57 ; 5,71 ; 2,14 ; 2,14 berturut-turut untuk formalin, glutaraldehid, iodium dan hipoklorit, begitu juga dengan bakteri Salmonella typhi, disinfektan aldehid dan halogen masih lebih efektif dengan nilai koefisien fenol 1,81 ; 2,72 ; 2,27 dan 2,27 berturut-turut untuk formalin, glutaraldehid, iodium dan hipoklorit. Macam-macam desinfektan yang sering digunakan yaitu : alkohol, aldehid, biguanid, senyawa halogen, dan fenol (Irianto, 2006).

2.4. Pengertian Media

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Anonim, 1995).

2.5. Macam-macam Media

Menurut Pelczar (1986), ada 3 macam media pertumbuhan pada bakteri yaitu :

1) Medium berdasarkan sifat fisik

- Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelah dingin media menjadi padat.

- Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semi solid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue) semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh media.

- Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth), LB (Lactose Broth).

2) Medium berdasarkan komposisi

- Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.

- Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk bahan ekstrak kentang, kita tidak dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.

- Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahan dasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.

3) Medium berdasarkan tujuan

- Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient Broth, Blood Agar.

- Media selektif/penghambat

Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline. Salt broth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran terhadap garam.

- Media diperkaya (enrichment)

Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah, serum, kuning telur. Media diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum Agar, dll.

- Media untuk peremajaan kultur

Media umum atau spesifik yang digunakan untuk peremajaan kultur

- Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.

Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolisme suatu mikroba. Contohnya adalah Koser’s Citrate medium, yang digunakan untuk menguji kemampuan menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.

- Media untuk karakterisasi bakteri

Media yang digunakan untuk mengetahui kemempuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate Broth, Lactose Broth, Arginine Agar.

- Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari campurannya berdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media diferensial, misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni.

2.6. Penanaman Mikroba (Inokulasi)

Pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak ketelitian. Terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut-paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril; ini untuk menghindari kontaminasi, yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kita inginkan. Maka sebelum itu kita harus menyiapkan hal-hal sebagai berikut :

a. Menyiapkan ruangan

Ruang tempat inokulasi itu kecil, bersih, dan bebas angin. Dinding ruang yang basah menyebabkan butir-butir debu menempel kepadanya. Pada waktu mengadakan inokulasi, baik sekali jika meja tempat inokulasi itu didasari dengan kain basah. Pekerjaan inokulasi dapat dilakukan juga di dalam suatu kotak berkaca (ent-kas). Dalam laboratorium untuk membuat vaksin, serum dan sebagainya, udara yang masuk ke dalam ruangan itu dilewatkan saringan yang disinari dengan sinar ultra-ungu.

b. Pemindahan dengan kata inokulasi

Ujung kawan inokulasi sebaiknya dari platina atau dari nikrom; ujung itu boleh lurus, boleh juga berupa kolongan yang berdiameter 1 – 3 mm. Lebih dahulu ujung kawat ini dipijarkan, sedang sisanya sampai tangkai cukup dilewatkan nyala api saja. Setelah dingin kembali, ujung kawat itu disentuhkan suatu koloni. Mulut tabung tempat pemiaraan itu dipanasi juga setelah sumbatnya diambil. Setelah pengambilan inokulum (yaitu sampel bakteri) selesai, mulut tabung dipanasi lagi kemudian disumbat seperti semula. Ujung kawat yang membawakan inokulum tersebut digesekkan pada medium baru atau pada suatu kaca benda, kalau tujuannya memang akan membuat suatu sediaan.

c. Pemindahan dengan pipet

Cara ini dilakukan misalnya pada penyelidikan air minum atau pada penyelidikan susu. Untuk itu diambillah 1 ml contoh untuk diencerkan dengan 99 ml air murni yang steril. Kemudian diambil 1 ml dari enceran ini untuk dicampur-adukkan dengan medium agar-agar yang masih dalam keadaan cair (suhu antara 42 – 45^oC). Lalu agar-agar yang masih encer ini dituangkan di cawan Petri. Setelah agar-agar membeku, maka cawan Petri yang berisi piaraan baru itu disimpan dalam tempat yang aman, misalnya di dalam almari atau di dalam laci.

d. Teknik penanaman

· Teknik penanaman dari suspensi

Teknik penanaman ini merupakan lajutan dari pengenceran bertingkat. Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung pengenceran terakhir.

1. Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.

2. Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45^oC) untuk dituang bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O₂dan ada yang tumbuh di dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen.

· Teknik penanaman dengan goresan

Bertujuan untuk mengisolasi mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium baru.

1. Goresan Sinambung

2. Goresan T

3. Goresan Kuadran

(Koesmadji, 2002)

2.7. Bakteri dan Macam-macam Bakteri

2.7.1. Pengertian Bakteri

Bakteri (dari kata Latin bacterium; jamak: bacteria) adalah kelompok organisme yang tidak memiliki membran inti sel.Organisme ini termasuk ke dalam domain prokariota dan berukuran sangat kecil (mikroskopik), serta memiliki peran besar dalam kehidupan di bumi. Beberapa kelompok bakteri dikenal sebagai agen penyebab infeksi dan penyakit, sedangkan kelompok lainnya dapat memberikan manfaat dibidang pangan, pengobatan, dan industri.Struktur sel bakteri relatif sederhana: tanpa nukleus/inti sel, kerangka sel, dan organel-organel lain seperti mitokondria dan kloroplas.Hal inilah yang menjadi dasar perbedaan antara sel prokariot dengan sel eukariot yang lebih kompleks (Bardy, 2003).

Bakteri dapat ditemukan di hampir semua tempat: di tanah, air, udara, dalam simbiosis dengan organisme lain maupun sebagai agen parasit (patogen), bahkan dalam tubuh manusia. Pada umumnya, bakteri berukuran 0,5-5 μm, tetapi ada bakteri tertentu yang dapat berdiameter hingga 700 μm, yaitu Thiomargarita. Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel tumbuhan dan jamur, tetapi dengan bahan pembentuk sangat berbeda (peptidoglikan).Beberapa jenis bakteri bersifat motil (mampu bergerak) dan mobilitasnya ini disebabkan oleh flagel.Bakteri merupakan organisme mikroskopik.Hal ini menyebabkan organisme ini sangat sulit untuk dideteksi, terutama sebelum ditemukannya mikroskop.Barulah setelah abad ke-19 ilmu tentang mikroorganisme, terutama bakteri (bakteriologi), mulai berkembang.Seiring dengan perkembangan ilmu pengetahuan, berbagai hal tentang bakteri telah berhasil ditelusuri. Akan tetapi, perkembangan tersebut tidak terlepas dari peranan berbagai tokoh penting seperti Robert Hooke, Antoni van Leeuwenhoek, Ferdinand Cohn, dan Robert Koch. Istilah bacterium diperkenalkan di kemudian hari oleh Ehrenberg pada tahun 1828, diambil dari kata Yunani βακτηριον (bakterion) yang memiliki arti "batang-batang kecil".Pengetahuan tentang bakteri berkembang setelah serangkaian percobaan yang dilakukan oleh Louis Pasteur, yang melahirkan cabang ilmu mikrobiologi. Bakteriologi adalah cabang mikrobiologi yang mempelajari biologi bakteri (Madigan, 2010).

Robert Hooke (1635-1703), seorang ahli matematika dan sejarahwan berkebangsaan Inggris, menulis sebuah buku yang berjudul Micrographia pada tahun 1665 yang berisi hasil pengamatan yang dilakukan dengan menggunakan mikroskop sederhana.Akan tetapi, Robert Hooke masih belum dapat menumukan struktur bakteri.Dalam bukunya tersebut, tergambar hasil penemuannya mengenai tubuh buah kapang.Walau demikian, buku inilah yang menjadi sumber deskripsi awal dari mikroorganisme (Madigan, 2010).

Seperti prokariot (organisme yang tidak memiliki membran inti) pada umumnya, semua bakteri memiliki struktur sel yang relatif sederhana. Sehubungan dengan ketiadaan membran inti, meteri genetik (DNA dan RNA) bakteri melayang-layang di daerah sitoplasma yang bernama nukleoid. Salah satu struktur bakteri yang penting adalah dinding sel. Bakteri dapat diklasifikasikan dalam dua kelompok besar berdasarkan struktur dinding selnya, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri gram positif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tersusun dari lapisan peptidoglikan (sejenis molekul polisakarida) yang tebal dan asam teikoat, sedangkan bakteri gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang lebih tipis dan mempunyai struktur lipopolisakarida yang tebal. Metode yang digunakan untuk membedakan kedua jenis kelompok bakteri ini dikembangkan oleh ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram pada tahun 1884 (Madigan, 2010).

Banyak bakteri memiliki struktur di luar sel lainnya seperti flagel dan fimbria yang digunakan untuk bergerak, melekat dan konjugasi. Banyak spesies bakteri yang bergerak menggunakan flagel (Berg, 2002). Bakteri yang tidak memiliki alat gerak biasanya hanya mengikuti pergerakan media pertumbuhannya atau lingkungan tempat bakteri tersebut berada. Sama seperti struktur kapsul, flagel juga dapat menjadi agen penyebab penyakit pada beberapa spesies bakteri. Berdasarkan tempat dan jumlah flagel yang dimiliki, bakteri dibagi menjadi lima golongan, yaitu:

^·Atrik, tidak mempunyai flagel.

^·Monotrik, mempunyai satu flagel pada salah satu ujungnya.

^·Lofotrik, mempunyai sejumlah flagel pada salah satu ujungnya.

^·Amfitrik, mempunyai satu flagel pada kedua ujungnya.

^·Peritrik, mempunyai flagel pada seluruh permukaan tubuhnya.

(Rollins, 2004)

Beberapa bakteri juga memiliki kapsul yang beperan dalam melindungi sel bakteri dari kekeringan dan fagositosis. Struktur kapsul inilah yang sering kali menjadi faktor virulensi penyebab penyakit, seperti yang ditemukan pada Escherichia coli dan Streptococcus pneumoniae. Bakteri juga memiliki kromosom, ribosom, dan beberapa spesies lainnya memiliki granula makanan, vakuola gas, dan magnetosom (Margossch, 2006). Beberapa bakteri mampu membentuk diri menjadi endospora yang membuat mereka mampu bertahan hidup pada lingkungan ekstrim. Clostridium botulinum merupakan salah satu contoh bakteri penghasil endospora yang sangat tahan suhu dan tekanan tinggi, dimana bakteri ini juga termasuk golongan bakteri pengebab keracunan pada makanan kaleng. Berdasarkan bentuknya bakteri dibagi menjadi 3 jenis yaitu : (1) Coccus; (2) Bacillus; (3) Spiral. Bentuk tubuh/morfologi bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium, dan usia. Walaupun secara morfologi berbeda-beda, bakteri tetap merupakan sel tunggal yang dapat hidup mandiri bahkan saat terpisah dari koloninya (Rollins, 2004).

Bakteri merupakan mikroorganisme ubikuotus, yang berarti melimpah dan banyak ditemukan di hampir semua tempat. Habitatnya sangat beragam; lingkungan perairan, tanah, udara, permukaan daun, dan bahkan dapat ditemukan di dalam organisme hidup. Diperkirakan total jumlah sel mikroorganisme yang mendiami muka bumi ini adalah 5x10³⁰. Bakteri dapat ditemukan di dalam tubuh manusia, terutama di dalam saluran pencernaan yang jumlah selnya 10 kali lipat lebih banyak dari jumlah total sel tubuh manusia. Oleh karena itu, kolonisasi bakteri sangatlah mempengaruhi kondisi tubuh manusia (Maier, 2009).

Thermus aquatiqus, bakteri termofilik yang banyak diaplikasikan dalam bioteknologi.

Terdapat beragam jenis bakteri yang mampu menghabitasi daerah saluran pencernaan manusia, terutama pada usus besar, diantaranya adalah bakteri asam laktat dan kelompok enterobacter . Contoh bakteri yang biasa ditemukan adalah Lactobacillus acidophilus. Di samping itu, terdapat pula kelompok bakteri lain, yaitu probiotik, yang bersifat menguntungkan karena dapat menunjang kesehatan dan bahkan mampu mencegah terbentuknya kanker usus besar.Selain di dalam saluran pencernaan, bakteri juga dapat ditemukan di permukaan kulit, mata, mulut, dan kaki manusia. Di dalam mulut dan kaki manusia terdapat kelompok bakteri yang dikenal dengan nama metilotrof, yaitu kelompok bakteri yang mampu menggunakan senyawa karbon tunggal untuk menyokong pertumbuhannya. Di dalam rongga mulut, bakteri ini menggunakan senyawa dimetil sulfida yang berperan dalam menyebabkan bau pada mulut manusia. Beberapa kelompok mikroorganisme ini mampu hidup di lingkungan yang tidak memungkinkan organisme lain untuk hidup. Kondisi lingkungan yang ekstrim ini menuntut adanya toleransi, mekanisme metabolisme, dan daya tahan sel yang unik. Sebagai contoh, Thermus aquatiqus merupakan salah satu jenis bakteri yang hidup pada sumber air panas dengan kisaran suhu 60-80 ^oC (Madigan, 2010). Tidak hanya di lingkungan bersuhu tinggi, bakteri juga dapat ditemukan pada lingkungan dengan suhu yang sangat dingin. Pseudomonas extremaustralis ditemukan pada Antartika dengan suhu di bawah 0 ^oC. Di samping pengaruh ekstrim temperatur, bakteri juga dapat hidup pada berbagai lingkungan lain yang hampir tidak memungkinkan adanya kehidupan (lingkungan steril). Halobacterium salinarum dan Halococcus sp. adalah contoh dari bakteri yang dapat hidup pada kondisi garam (NaCl) yang sangat tinggi (15-30%).Tedapat pula beberapa jenis bakteri yang mampu hidup pada kadar gula tinggi (kelompok osmofil), kadar air rendah (kelompok xerofil), derajat keasaman pH sangat tinggi, dan rendah (Neidleman, 1993).

Beberapa macam peranan bakteri dalam berbagai macam bidang yaitu:

· Bidang Lingkungan

Keanekaragaman bakteri dan jalur metabolismenya menyebabkan bakteri memiliki peranan yang besar bagi lingkungan. Sebagai contoh, bakteri saprofit menguraikan tumbuhan atau hewan yang telah mati dan sisa-sisa atau kotoran organisme. Bakteri tersebut menguraikan protein, karbohidrat dan senyawa organik lain menjadi CO₂, gas amoniak, dan senyawa-senyawa lain yang lebih sederhana. Contoh bakteri saprofit antara lain Proteus dan Clostridium. Tidak hanya berperan sebagai pengurai senyawa organik, beberapa kelompok bakteri saprofit juga merupakan patogen oportunis.

Frankia alni, salah satu bakteri pengikat N₂ yang berasosiasi dengan tanaman membentuk bintil akar

Kelompok bakteri lainnya berperan dalam siklus nitrogen, seperti bakteri nitrifikasi. Bakteri nitrifikasi adalah kelompok bakteri yang mampu menyusun senyawa nitrat dari senyawa amonia yang pada umumnya berlangsung secara aerob di dalam tanah. Kelompok bakteri ini bersifat kemolitotrof. Nitrifikasi terdiri atas dua tahap yaitu nitritasi (oksidasi amonia (NH₄) menjadi nitrit (NO₂^-)) dan nitratasi (oksidasi senyawa nitrit menjadi nitrat (NO₃)). Dalam bidang pertanian, nitrifikasi sangat menguntungkan karena menghasilkan senyawa yang diperlukan oleh tanaman yaitu nitrat. Setelah reaksi nitrifikasi selesai, akan terjadi proses dinitrifikasi yang dilakukan oleh bakteri denitrifikasi. Denitrifikasi sendiri merupakan reduksi anaerobik senyawa nitrat menjadi nitrogen bebas (N₂) yang lebih mudah diserap dan dimetabolisme oleh berbagai makhluk hidup. Contoh bakteri yang mampu melakukan metabolisme ini adalah Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa, and Paracoccus denitrificans.Di samping itu, reaksi ini juga menghasilkan nitrogen dalam bentuk lain, seperti dinitrogen oksida (N₂O). Senyawa tersebut tidak hanya dapat berperan penting bagi hidup berbagai organisme, tetapi juga dapat berperan dalam fenomena hujan asam dan rusaknya ozon. Senyawa N₂O akan dioksidasi menjadi senyawa NO dan selanjutnya bereaksi dengan ozon (O₃) membentuk NO₂^- yang akan kembali ke bumi dalam bentuk hujan asam (HNO₂). Di bidang pertanian dikenal adanya suatu kelompok bakteri yang mampu bersimbiosis dengan akar tanaman atau hidup bebas di tanah untuk membantu penyuburan tanah. Kelompok bakteri ini dikenal dengan istilah bakteri pengikat nitrogen atau singkatnya bakteri nitrogen. Bakteri nitrogen adalah kelompok bakteri yang mampu mengikat nitrogen (terutaman N₂) bebas di udara dan mereduksinya menjadi senyawa amonia (NH₄) dan ion nitrat (NO₃^-) oleh bantuan enzim nitrogenase. Kelompok bakteri ini biasanya bersimbiosis dengan tanaman kacang-kacangan dan polong untuk membentuk suatu simbiosis mutualisme berupa nodul atau bintil akar untuk mengikat nitrogen bebas di udara yang pada umumnya tidak dapat digunakan secara langsung oleh kebanyakan organisme (Maier, 2009).

· Bidang Pangan

Terdapat beberapa kelompok bakteri yang mampu melakukan proses fermentasi dan hal ini telah banyak diterapkan pada pengolahan berbagi jenis makanan. Bahan pangan yang telah difermentasi pada umumnya akan memiliki masa simpan yang lebih lama, juga dapat meningkatkan atau bahkan memberikan cita rasa baru dan unik pada makanan tersebut. Beberapa makanan hasil fermentasi dan mikroorganisme yang berperan:

No.	Nama Produk	Bahan Baku	Bakteri yang berperan
1.	Yoghurt	susu	Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus
2.	Mentega	susu	Streptococcus lactis
3.	Terasi	ikan	Lactobacillus sp.
4.	Asinan buah-buahan	Buah-buahan	Lactobacillus sp.
5.	Sosis	daging	Pediococcus cerevisiae

(Nikiyan, 2010)

· Bidang Kesehatan

Tidak hanya di bidang lingkungan dan pangan, bakteri juga dapat memberikan manfaat dibidang kesehatan. Antibiotik merupakan zat yang dihasilkan oleh mikroorganisme dan mempunyai daya hambat terhadap kegiatan mikroorganisme lain dan senyawa ini banyak digunakan dalam menyembuhkan suatu penyakit. Beberapa bakteri yang menghasilkan antibiotik adalah:

- Streptomyces griseus, menghasilkan antibiotik streptomycin^[

- Streptomyces aureofaciens, menghasilkan antibiotik tetracycline

- Streptomyces venezuelae, menghasilkan antibiotik chloramphenicol

- Penicillium, menghasilkan antibiotik penisilin

- Bacillus polymyxa, menghasilkan antibiotik polymixin

Terlepas dari peranannya dalam menghasilkan antibiotik, banyak jenis bakteri yang justru bersifat patogen. Pada manusia, beberapa jenis bakteri yang sering kali menjadi agen penyebab penyakit adalah Salmonella enterica subspesies I serovar Typhi yang menyebabkan penyakit tifus, Mycobacterium tuberculosis yang menyebabkan penyakit TBC, dan Clostridium tetani yang menyebabkan penyakit tetanus. Bakteri patogen juga dapat menyerang hewan ternak, seperti Brucella abortus yang menyebabkan brucellosis pada sapi dan Bacillus anthracis yang menyebabkan antraks. Untuk infeksi pada tanaman yang umum dikenal adalah Xanthomonas oryzae yang menyerang pucuk batang padi dan Erwinia amylovora yang menyebabkan busuk pada buah-buahan (Margosch, 2006).

2.7.2. Macam-macam Bakteri

Menurut Pelczar (1986), bakteri berdasarkan cara memperoleh makanannya dan kebutuhan oksigennya terbagi menjadi 2 jenis yaitu :

a. Bakteri heterotrof

Bakteri heterotrof adalah bakteri yang hidup dan memperoleh
makanan dari lingkungannya karena tidak dapat membuat makanan
hidup yang ditumpanginya karena dapat menimbulkan penyakit. Contoh penyakit yang disebabkan oleh bakteri ini, antara lain, kolera disebabkan oleh bakteri Vibrio cholerae, TBC disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis, disentri disebabkan oleh bakteri Shigella dysenterriae, sifilis disebabkan oleh bakteri Treponema pallidum, dan radang paru-paru (pneumoniae) disebabkan oleh bakteri Diplococcus pneumoniae. Penularan penyakit yang disebabkan oleh bakteri dapat melalui makanan, minuman, pernapasan, ataupun kontak langsung dengan penderita, baik secara langsung maupun tidak langsung.

b. Bakteri autotrof

Bakteri autotrof adalah bakteri yang dapat membuat makanannya
sendiri. Berdasarkan asal energi yang digunakan, bakteri autotrof dapat dibedakan menjadi dua, yaitu bakteri yang bersifat kemoautotrof dan bakteri yang bersifat fotoatotrof. Bakteri kemoautotrof adalah bakteri yang membuat makanannya dengan bantuan energi yang berasal dari reaksi-reaksi kimia, misalnya, proses oksidasi senyawa tertentu. Contohnya, bakteri nitrit dengan mengoksidkan NH3, bakteri nitrat dengan mengoksidkan HNO2, bakteri belerang dengan mengoksidkan senyawa belerang, Nitosococcus, dan Nitrobacter. Bakteri fotoautotrof adalah bakteri yang membuat makanannya dengan bantuan energi yang berasal dari cahaya matahari. Bakteri ini adalah bakteri yang mengandung zat warna hijau sehingga dapat melakukan fotosintesis, seperti tumbuhan hijau. Contohnya bakteri-bakteriyang mempunyai zat warna, antara lain, dari golongan Thiorhodaceae (bakteri belerang berzat warna).

Menurut Volk (1988), bakteri berdasarkan kebutuhan oksigennya, bakteri dapat dibedakan menjadi bakteri aerob dan bakteri anaerob :

a. Bakteri aerob

Bakteri aerob adalah bakteri yang hidupnya memerlukan oksigen bebas. Bakteri yang hidup secara aerob dapat memecah gula menjadi air, CO2, dan energi. Bakteri aerob secara obligat adalah bakteri yang mutlak memerlukan oksigen bebas dalam hidupnya, misalnya, bakteri Nitrosomonas.

b. Bakteri anaerob

Bakteri anaerob adalah bakteri yang dapat hidup tanpa oksigen
bebas, misalnya, bakteri asam susu, bakteri Lactobacillus bulgaricus, dan Clostridium tetani. Akan tetapi, jika bakteri tersebut dapat hidup tanpa kebutuhan oksigen secara mutlak atau dapat hidup tanpa adanya oksigen, bakteri itu disebut bakteri anaerob fakultatif.

2.8. Pewarnaan Bakteri

Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat (Dwidjoseputro, 2005).

Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Widjoseputro, 1989).

Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :

1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.

2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad.

3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.

4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.

2.9. Teknik Pewarnaan

Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul (Waluyo, 2010).

Langkah-langkah utama teknik pewarnaan :

1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis

2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.

3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Teknik pewarnaan dikelompokkan menjadi beberapa tipe, berdasarkan respon sel bakteri terhadap zat pewarna dan sistem pewarnaan yang digunakan untuk pemisahan kelompok bakteri digunakan pewarnaan Gram, dan pewarnaan “acid-fast”(tahan asam) untuk genus Mycobacterium. Untuk melihat struktur digunakan pewarnaan flagela, pewarnaan kapsul, pewarnaan spora, dan pewarnaan nukleus. Pewarnaan Neisser atau Albert digunakan untuk melihat granula metakromatik (volutin bodies) pada Corynebacterium diphtheriae. Untuk semua prosedur pewarnaan mikrobiologi dibutuhkan pembuatan apusan lebih dahulu sebelum melaksanakan beberapa teknik pewarnaan yang spesifik (Pelczar, 1986). Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut:

1. Pewarnaan sederhana

Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).

Gambar pewarnaan sederhana

2. Pewarnaan differensial dibagi pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam

Pewarnaan differensial

Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:

· Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.

Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram. Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :

Ø Zat warna utama (violet kristal)

Ø Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.

Ø Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

Ø Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.

Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu

1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).

Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:

Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:

· Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.

· Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam

· lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.

· Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

· Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.

· Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.

· Tidak resisten terhadap gangguan fisik.

· Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat

· Peka terhadap streptomisin

· Toksin yang dibentuk Endotoksin

Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:

· Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.

· Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.

· Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.

· Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.

· Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.

· Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

· Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut

· Tidak peka terhadap streptomisin

· Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

Contoh bakteri gram positif Contoh bakteri gram negatif

(http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram)

Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini ditujukan terhadap bakteri yang mengandung lemak dalam konsentrasi tinggi sehingga sukar menyerap zat warna, namun jika bakteri diberi zat warna khusus misalnya karbolfukhsin melalui proses pemanasan, maka akan menyerap zat warna dan akan tahan diikat tanpa mampu dilunturkan oleh peluntur yang kuat sekalipun seperti asam-alkohol. Karena itu bakteri ini disebut bakteri tahan asam (BTA). Teknik pewarnaan ini dapat digunakan untuk mendiagnosa keberadaan bakteri penyebab tuberkulosis yaitu Mycobacterium tuberculosis . Ada beberapa cara pewarnaan tahan asam, namun yang paling banyak adalah cara menurut Ziehl-Neelsen (Irianto, 2006).

Bakteri Tahan Asam (pink) dan bakteri Tidak Tahan Asam (biru)

3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.

Pewarnaan Spora

Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora , seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium (Waluyo, 2010).

Skema prosedur pengecatan Spora Schaeffer Fulton

(http://images.suite101.com/400620_com_endosporestainprocpscanite)

Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel (Waluyo, 2010).

Pewarnaan kapsul

Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap (Waluyo, 2010).

4. Pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri :

a. Pewarnaan Neisser (granula volutin)

b. Pewarnaan yodium (granula glikogen)

5. Pewarnaan negatif

Tujuan: Mempelajari penggunaan prosedur pewarnaan negatif untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang. Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta

Cara pewarnaan negatif

- Sediaan hapus → teteskan emersi → lihat di mikroskop

Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin.pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna (Koesmadji, 2002).

2.10. Teknik Aseptis

Teknik aseptis sangat penting dalam pengerjaan mikrobiologi yang memerlukan ketelitian dan keakuratan disamping kesterilan yang harus selalu dijaga agar terbebas dari kontaminan yang dapat mencemari. Populasi mikroba di alam sekitar kita sangat besar dan komplek. Beratus-ratus spesies berbagai mikroba biasanya menghuni bermacam-macam bagian tubuh kita, termasuk mulut, saluran pencernaan, dan kulit. Sekali bersin terdapat beribu-ribu mikroorganisme sehingga diperlukan teknik yang dapat meminimalisirnya seperti pengisolasian (Pelczar, 1986).

Salah satu teknik dasar dalam analisa mikrobiologi adalah teknik transfer aseptis (suatu metode atau teknik di dalam memindahkan atau mentransfer kultur bakteria dari satu tempat ke tempat lain secara aseptis agar tidak terjadi kontaminasi oleh mikroba lain ke dalam kultur). Teknik ini sangat esensial dan kunci keberhasilan prosedur mikrobial yang harus diketahui oleh seorang yang hendak melakukan analisis mikrobiologi. Pengambilan sampel harus dilakukan secara statistik agar tidak bias, jadi secara acak (random sampling). Selain itu, digunakan teknik aseptis selama pengambilan sampel agar tidak terjadi pencemaran. Alat-alat yang digunakan harus steril. Bahan makanan cair diambil dengan pipet steril, makanan padat menggunakan pisau, garpu, sendok atau penjepit yang steril (Irianto, 2006).

BAB III

MATERI DAN METODE

3.1. Waktu dan Tempat

Hari, Tanggal : Rabu, 23 November 2011

Pukul : 15.00 - 17.00 WIB

Tempat : Laboratorium Mikrobiologi, Lt. II Gedung E Jurusan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Universitas Diponegoro, Semarang

3.2. Alat dan Bahan

3.2.1. Alat

No.	Nama Alat	Gambar	Kegunaan
1.	Autoklaf		Mensterilisasikan alat/media pada suhu 121 ⁰C
2.	Inkubator		Berfungsi untuk menginkubasi mikroba yang diinginkan pada suhu optimum pertumbuhannya
3.	Desinfektan / Alkohol		Pembersih/antiseptik pada alat dan media bakteri
4.	Bunsen		Digunakan untuk memanaskan medium, mensterilkan jarum inokulasi dan alat-alat yang terbuat dari platina dan nikrom seperti jarum platina dan ose
5.	Cawan petri		Digunakan sebagai wadah penyimpanan dan pembuatan kultur media
6.	Timbangan analitik		Berfungsi untuk menimbang bahan yang akan digunakan dalam praktikum dengan tingkat ketelitian yang tinggi
7.	Aluminium foil		Digunakan sebagai wadah bahan pembuatan media pada saat ditimbang
8.	Erlenmeyer		Fungsinya untuk menyimpan medium, menyimpan larutan sisa, atau larutan yang akan dipergunakan, dan tempat untuk menyimpan medium yang akan disterilkan
9.	Tabung reaksi		Digunakan sebagai wadah penyimpanan medium atau larutan yang akan disterilkan
10.	Gelas ukur		Berfungsi untuk mengukur volume larutan yang akan digunakan
11.	Batang pengaduk		Berfungsi untuk mengaduk bahan kimia atau menghomogenkan medium yang akan dibuat
12.	Pipet tetes		Digunakan untuk mengambil dan memindahkan larutan yang akan digunakan dan dikeluarkan tetes per tetes
13.	Kapas		Digunakan untuk menutup bagian mulut erlenmeyer sebelum dipanaskan dalam autoklaf

3.2.2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media Zobell’s 2216 e yaitu :

- Pepton 0,25 gr

- Ekstrat yeast 0,05 gr

- Bacto agar 1,5 gr

- Aquadest 100 ml

3.3. Cara Kerja

3.3.1. Teknik Sterilisasi

3.3.1.1. Sterilisasi menggunakan autoklaf

Cara penggunaan autoklaf untuk mensterilkan alat atau media bakteri yaitu sebagai berikut :

- Sebelum melakukan sterilisasi cek dahulu banyaknya air dalam autoklaf. Jika air kurang dari batas yang ditentukan, maka dapat ditambah air sampai batas tersebut. Gunakan air hasil destilasi, untuk menghindari terbentuknya kerak dan karat.

- Masukkan peralatan dan bahan. Jika mensterilisasi botol beretutup ulir, maka tutup harus dikendorkan.

- Tutup autoklaf dengan rapat lalu kencangkan baut pengaman agar tidak ada uap yang keluar dari bibir autoklaf. Klep pengaman jangan dikencangkan terlebih dahulu.

- Nyalakan autoklaf, diatur timer dengan waktu minimal 15 menit pada suhu 121^oC.

- Tunggu samapai air mendidih sehingga uapnya memenuhi kompartemen autoklaf dan terdesak keluar dari klep pengaman. Kemudian klep pengaman ditutup (dikencangkan) dan tunggu sampai selesai. Penghitungan waktu 15’ dimulai sejak tekanan mencapai 2 atm.

- Jika alarm tanda selesai berbunyi, maka tunggu tekanan dalam kompartemen turun hingga sama dengan tekanan udara di lingkungan (jarum pada preisure gauge menunjuk ke angka nol). Kemudian klep-klep pengaman dibuka dan keluarkan isi autoklaf dengan hati-hati.

3.3.1.2. Sterilisasi menggunakan bunsen

- Nyalakan pembakar bunsen dengan cara membuka tutupnya.

- Sterilkan jarum ose dengan membakar ujung jarum yang terbuat dari logam pada api bunsen.

- Peganglah jarum dengan posisi agak tegak di atas api (± 45°), bakar jarum hingga berpijar dan pijaran tersebut merambat hingga pangkal bagian logam jarum.

- Bila sudah selesai, tunggu beberapa detik hingga suhu ose kembali normal. Atau sentuhkan ujung ose pada permukaan media hingga terdengar bunyi ”ches”.

3.3.1.3. Sterilisasi menggunakan inkubator

- Buka tutup inkubator dan masukkan peralatan dari gelas yang sudah dibungkus ke dalam inkubator.

- Tutup inkubator dan atur pengontrol suhu pada angka 160-180°C selama 1-2 jam.

3.3.1.4. Sterilisasi menggunakan alkohol

Alkohol 70% disemprotkan pada area laboratorium tempat kita melakukan praktikum mikrobiologi.

3.3.2. Pembuatan Media Zobell’s 2166 e

a. Pembuatan media Zobell’s 2166 e untuk volume 100 ml pada cawan petri yaitu :

- Timbang kertas aluminium foil hingga 0 gr dan bahan-bahan lainnya sesuai ketentuan pada timbangan analitik.

- Masukkan pepton 0,25 gr, ekstrat yeast 0,05 gr, bacto agar 1,5 gr, serta tambahkan 100 ml aquadest pada erlenmeyer.

- Dipanaskan sambil diaduk hingga larutan media menjadi homogen.

- Diangkat, kemudian ditutup bagian mulut erlenmeyer dengan kapas dan alumunium foil.

- Masukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121 ⁰C hingga 15 menit.

- Keluarkan dari autoklaf kemudian dituangkan ke dalam cawan petri. Pada saat penuangan media ke cawan petri kondisi tempat kerja harus steril. Gunakan desinfektan untuk mengaseptiskan tangan kita serta bagian tempat kerja tersebut.

- Penuangan media ke cawan petri harus perlahan dan didekatkan pada bunsen agar tidak ada kontaminasi bakteri dari udara di sekitar cawan petri ataupun erlenmeyer. Usahakan agar media benar-benar terisi penuh dalam cawan petri maksimal 20 ml.

- Tutup cawan petri dengan cover/penutup cawan petri. Didiamkan sampai hangat sampai media di dalam cawan petri mengeras. Setelah mengeras balik bagian cover menjadi bottom pada cawan petri tersebut. Hal tersebut bertujuan agar uap air pada cawan petri hilang dan tidak mengganggu media di dalamnya kemudian setelah beberapa saat, media pun siap untuk digunakan untuk kultur.

- Setelah itu barulah cawan petri yang berisi media siap untuk disimpan. Sebelum disimpan, cawan petri dibungkus menggunakan plastik warp.

b. Pembuatan media Zobell’s 2166 e untuk volume 100 ml pada tabung reaksi yaitu :

- Timbang kertas aluminium foil hingga 0 gr dan bahan-bahan lainnya sesuai ketentuan pada timbangan analitik.

- Masukkan pepton 0,25 gr, ekstrat yeast 0,05 gr, bacto agar 1,5 gr, serta tambahkan 100 ml aquadest pada erlenmeyer.

- Dipanaskan sambil diaduk hingga larutan media menjadi homogen.

- Diangkat, kemudian dituangkan ke dalam tabung reaksi menggunakan pipet tetes. Pada saat pemindahan media dengan pipet tetes, usahakan agar tempat kerja harus tetap steril dari kontaminasi bakteri.

- Tutup bagian mulut tabung reaksi dengan kapas dan aluminium foil.

- Masukkan dalam autoklaf pada suhu 121 ⁰C hingga 15 menit.

- Keluarkan dari autoklaf, kemudian media yang ada di dalam tabung reaksi dimiringkan beberapa derajat (disebut media miring) sampai media tersebut berubah menjadi padat.

- Simpan media tersebut pada tempat yang aman dan usahakan agar tidak terjadi kontaminasi dengan bakteri lain (tetap steril).

3.3.3. Pewarnaan (Pengecatan)

1. Pembuatan Preparat Bakteri

Bakteri diratakan setipis mungkin di atas gelas benda yang bersih. Selanjutnya bakteri difiksasi dengan cara melakukan secara cepat di atas nyala api bunsen kira-kira 2 atau 3 kali. Smear sekarang siap untuk diwarnai.

2. Pengecatan Gram

- Bubuhkan kristal violet sampai smear terndam cat, biarkan selama 1 menit, kemudian cuci dengan air yang mengalir.

- Bubuhkan smear dengan Burke’s iodine selama 1 menit, cuci dengan air yang mengalir.

- Dekolonisani dengan atanol 95%, cuci dengan air yang mengalir.

- Keringkan dan anginkan preparat.

- Amati di bawah mikroskop dengan minyak imersi.

3. Pengecatan spora

- Bubuhkan cat malachite green pada smear, panaskan samapai cat menguap. Hindari preaparat mendidih. Cuci dengan air yang mengalir.

- Bubuhkan cat penutup dengan aqueous safranin, diamkan selama 1-2 menit. Cuci dengan air yang mengalir.

- Keringkan dan anginkan.

- Amati di bawah mikroskop dengan minyak inersi.

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil

4.1.1. Sterilisasi

1. Destroyed (Pemanasan)

a. Cawan petri atau alat mikrobiologi direbus di air mendidih

b. Ditunggu beberapa saat

c. Setelah beberapa menit dicuci dengan menggunakan sabun cuci dan air mengalir

d. Keringkan dengan cara meletakkan alat dalam posisi tengkurap

e. Membersihkan dengan tissue, kemudian menyemprot dengan alkohol 75%

f. Membungkus alat mikrobiologi dengan kertas biasa dengan teknik tertentu

g. Memasukkan ke autoklaf untuk proses pengeringan

2. Autoklaf

a. Sebelum dimasukkan dibungkus dengan kertas, sebelumnya disemprot alkohol

b. Autoklaf diisi air hingga kaki tiga terendam, kemudian alat dimasukkan ke autoklaf

c. Setelah suhu mencapai 121⁰C, mulai untuk menghitung waktu yang dibutuhkan untuk sterilisasi alat / media

d. Setelah selesai, tunggu hingga tekanan 0⁰C dan diamkan selama 5 menit

e. Membuka autokaf, kemudian alat diambil

3. Inkubator

a. Digunakan untuk sterilisasi kering pada suhu 171⁰C

b. Untuk mengeringkan alkohol yang tersisa agar tidak terdapat bercak dari alkohol tersebut pada alat

4. Bunsen

Digunakan untuk sterilisasi pada saat kita mengerjkan suatu pembuatan media ataupun semua hal yang berkaitan dengan praktikum mikrobiologi. Bunsen didekatkan dengan alat mikrobiologi agar tetap steril alat dan media yang kita buat.

5. Alkohol 70%

Alkohol 70% digunakan untuk sterilisasi area laboratorium yang digunakan untuk praktikum mikrobiologi. Dengan cara menyemprotkan alkohol 70% di sekitar atau sekeliling kita.

4.1.2. Pembuatan Media

Media Zobell’s 2166 e, dengan komposisi :

a. Pepton sebagai nutrient untuk bakteri

b. Bacto agar sebagai perekat pada zobell padat

c. Ekstrak Yeast sebagai nutrient untuk bakteri

d. Pada zobell cair tidak memerlukan bacto agar

e. Aquadest untuk melarutkan media yang akan dibuat

Cara kerja