LAPORAN
RESMI
PRAKTIKUM
DASAR-DASAR BIOTEKNOLOGI
“VISUALISASI
EKSTRAKSI DNA, ANALISIS SEQUEN DNA DENGAN BLAST DAN PENGOLAHAN DATA HASIL
IDENTIFIKASI SEQUEN MENGGUNAKKAN PROGRAM BIOINFORMATIKA”
TOPAN
EKA PRASTYA
26020110110002
IK
- A
PROGRAM
STUDI ILMU KELAUTAN
JURUSAN
ILMU KELAUTAN
FAKULTAS
PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS
DIPONEGORO
2012
BAB I
PENDAHALUAN
1.1 Latar Belakang
1.1.1 Pengertian
Bioteknologi
Bioteknologi
berasal dari dua kata, yaitu ‘bio’ yang berarti makhuk hidup dan
‘teknologi’ yang berarti cara untuk memproduksi barang. Dengan definisi
tersebut bioteknologi bukan merupakan sesuatu yang baru. Nenek moyang kita
telah memanfaatkan mikroba untuk membuat produk-produk berguna seperti tempe, oncom,
tape, arak, terasi, kecap, yogurt, dan nata de coco .Hampir semua
antibiotik berasal dari mikroba, demikian pula enzim-enzim yang dipakai untuk
membuat sirop fruktosa hingga pencuci pakaian.
Bioteknologi
adalah penggunaan biokimia, mikrobiologi, dan rekayasa genetika secara terpadu,
untuk menghasilkan barang atau lainnya bagi kepentingan manusia.Biokimia
mempelajari struktur kimiawi organisme. Rekayasa genetika adalah aplikasi
genetik dengan mentransplantasi gen dari satu organisme ke organisme lain.
Bioteknologi adalah cabang ilmu yang
mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan
lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam
proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan
bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata,
tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain
sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang
menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa (Sumber : Wikipedia).
Menurut
Jujun Ratnasari, S.Si., M.Si., bioteknologi adalah manipulasi organisme atau
komponen organisme tersebut untuk melakukan tugas praktis, menghasilkan produk
yang bermanfaat. Sejak berabad-abad bioteknologi yang menggunakan
mikroorganisme telah berlangsung secara tradisional, seperti pada proses
pembuatan anggur, bir, keju, sake, dan lain-lain. Proses tradisional ini hanya
menggunakan dan mengandalkan proses genetik alami dari mikroba.
Bioteknologi
merupakan suatu usaha terpadu dari berbagain disiplin ilmu untuk mengolah bahan
baku dengan memanfaatkan mikroorganisme dan komponen-komponen lainnyauntuk
menghasilkan barang dan jasa. Disiplin ilmu yang terlibat dalam bioteknologi,
di antaranya Kimia, Biokimia, Rekayasa Biokimia, Teknik Kimia, Mikrobiologi,
dan tentunya Biologi.
Menurut
Yuwono (2006 : 1), bioteknologi memiliki pengertian penerapan prinsip-prinsip
biologi, biokimia, dan rekayasa dalam pengolahan bahan dengan memanfaatkan
agensia jasad hidup dan komponen-komponennya untuk menghasilkan barang dan
jasa. Dengan melihat pengertian tersebut, semua produk atau jasa yang berasal
dari jasad hidup atau komponennya dan yang dihasilkan dari penerapan teknik
biologi, biokimia, dan rekayasa adalah produk atau jasa bioteknologi.
Dalam
batasan pengertian bioteknologi, ada beberapa ciri dari suatu proses
bioteknologi. Ciri-ciri tersebut sebagai berikut.
- Adanya agen biologi yang dipergunakan. Agen biologi yang dipergunakan ini tidak hanya dalam bentuk fisik yang dipanen, namun juga termasuk di dalamnya adalah hasil metabolit sekunder atau enzim yang dihasilkan.
- Penggunaan agen biologi dilakukan dengan suatu cara atau metode tertentu.
- Adanya produk turunan atau jasa yang dipakai dari proses pengguaan agen biologi tersebut.
Suatu proses industri bioteknologi
yang menggunakan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk, pada dasarnya
terdiri dari tiga tahap utama yaitu:
1. Proses hulu
dimana melibatkan serangkaian perlakuan pada bahan mentah sehingga dapat
digunakan sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme sasaran.
2.
Fermentasi dan transformasi adalah
pertumbuhan mikroorganisme sasaran dalam bioreaktor besar yang diikuti dengan
produksi bahan yang diinginkan, misalnya antibiotik, asam amino, enzim, atau
asam-asam organik
3.
Proses hilir adalah proses pemurnian
senyawa atau bahan yang diinginkan dari medium fermentasi atau dari massa sel.
1.1.2 Prinsip-prinsip
Dasar Bioteknologi
Ada beberapa
proses yang merupakan prinsip dasar dari bioteknologi, yaitu fermentasi,
seleksi dan persilangan, analisa genetik, kultur jaringan, rekombinasi DNA, dan
analisa DNA.
1. Fermentasi
Fermentasi adalah proses produksi
energi dalam sel dalam
keadaan anaerobik (tanpa oksigen). Secara
umum, fermentasi adalah salah satu bentuk respirasi anaerobik, akan
tetapi, terdapat definisi yang lebih jelas yang mendefinisikan fermentasi
sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan
tanpa akseptor elektron eksternal.
Fermentasi
merupakan proses dasar untuk mengubah suatu bahan menjadi bahan lain dengan
cara sederhana dan dibantu oleh mikroorganisme. Proses fermentasi ini merupakan
bioteknologi sederhana dan sudah dikenal sejak jaman dahulu. Contohnya pembutan
roti, minuman anggur, yoghurt, tuak dan sake.
2. Seleksi dan Persilangan
Proses
seleksi dilakukan dengan memenipulasi DNA yang ada pada mikroba, tanaman, atau
hewan agar menjadi mikroba, tanaman, atau hewan dengan sifat yang lebih baik
sehingga apabila disilangkan akan menjadi bibit unggul yang baik untuk masa
depan. Contohnya, ayam Leghorn, sapi ayrshire, padi Cisadane kedelai Muria, dan
jagung Metro.
3. Analisa Genetik
Proses ini
mempelajari cirri atau sifat dan gen makhluk hidup dari generasi ke generasi
untuk mendapatkan sifat atau ciri yang unggul serta interaksi antara gen dan
lingkungan agr menghasilkan keturunan yang baik.
4. Kultur Jaringan
Kultur jaringan atau biakan jaringan
merupakan teknik pemeliharaan jaringan atau bagian
dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan adalah
dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali
disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in
vitro (bahasa Latin, berarti
"di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan Petri dari kaca atau
material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara teoretis dapat
dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan (termasuk manusia) namun
masing-masing jaringan memerlukan komposisi media tertentu.
Selain itu,
kultur jaringan diartikan juga sebagai proses menumbuhkan atau memperbanyak
jaringan hewan dan tanaman dari jaringan atau selnya di dalam laboratorium
tanpa mendapat gangguan dari organisme lain. Proses ini dimanfaatkan untuk
perbanyakan, produksi bahan-bahan kimia, dan riset di bidang pengobatan.
Contohnya kultur jaringan anggrek dan pisang.
Pelaksanaan teknik ini memerlukan
berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang
paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media
adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung
kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan
jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media
tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi
dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair
dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan.
Teori dasar dari kultur in vitro ini
adalah Totipotensi.Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat
berkebang biak, karena seluruh bagian tanaman
terdiri atas jaringan - jaringan hidup.
Tahapan yang
dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah
- Pembuatan media
- Inisiasi
- Sterilisasi
- Multiplikasi
- Pengakaran
- Aklimatisasi
Media merupakan
faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media
yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media
yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.
Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan
lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi,
baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan
yang dilakukan. Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau
botol-botol kaca. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara
memanaskannya dengan autoklaf.
Inisiasi adalah
pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman
yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.
Sterilisasi
adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat
yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga
steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol
yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi
yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.
Multiplikasi
adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media.
Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya
kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi
yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat
yang steril dengan suhu kamar.
Pengakaran
adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang
menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan
baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan
perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun
jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna
putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).
Aklimatisasi
adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng.
Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan
sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan
hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap
serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan
lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan
bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit
generatif.
5. Rekombinasi DNA
Proses
transfer segmen DNA dari satu organisme ke DNA organisme lain dinamakan
rekombinasi DNA. Kedua organisme itu dapat saja tidak memiliki hubungan atau
kekerabatan.Contohnya, penyisipan gen manusia pada bakteri Bacillus
thuringiensis sehingga bakteri tersebut dapat memproduksi insulin.
Rekombinasi
merupakan hasil teknologi atau rekombinasi DNA di laboratorium.Dengan teknologi
DNA dapat diproduksi atau dibuat fragmen DNA tertentu.Enzim digunakan
untuk memotong fragmen DNA dan menempelkan fragmen DNA ke tempat yang
diinginkan.Enzim
restriksi digunakan untuk memotong fragmen DNA menjadi fragmen-fragmen.Sementara enzim DNA ligase menyambungkan antar fragmen DNA.Dengan pemotongan dan penyambungan kembali bagian yang diinginkan dapat
didesain urutan DNA sesuai kode yang diinginkan atau gen yang diinginkan.
Gen dapat
diklon dalam plasmid rekombinan, plasmid buatan hasil rekombinasi.Plasmid
adalah DNA sirkuler yang dimiliki bakteri dapat bereplikasi dan diturunkan
ketika sel bakteri membelah. Plasmid diartikan juga sebagai salah satu vektor
atau pembawa rekombinan gen atau rekombinan DNA. Gen yang telah diklon dapat disimpan dalam pustaka genom berupa plasmid
rekombinan atau virus DNA rekombinan. Enzim reverse transcriptase dapat membuat DNA dari RNA dan kemudian DNA
hasilnya dapat diklon.Molekul probe atau molekul penanda dapat digunakan untuk mengidentifikasi
gen khusus yang dibawa suatu DNA (gen) klon. Ada alat otomatik untuk membuat proses sintesa DNA yang cepat dan
mensekuens urutan DNA.
Metoda untuk
menganalisa fragmen DNA hasil kerja enzim restriksi dan mendeteksi perbedaan
fragmen yang dihasilkan telah ada Metode PCR dapat memperbanyak sampel DNA yang
dituju.Rekayasa genetika pada sel bakteria, yeast, tanaman, hewan digunakan untuk
menghasilkan produk gen secara massal.Kelebihan teknologi DNA atau rekayasa
genetika menjadi penyebab revolusi pada industri farmasi dan pengobatan
manusia, bidang pertanian, dan rekayasa genetika sudah sangat akrab, hewan
transgenik dan pengembangan riset masa kini.Kekurangan teknologi DNA membawa
risiko, menimbulkan pertanyaan etika yang penting.
6. Analisis DNA
Proses
reaksi rantai polymerase sehingga dapat membuat kopi (salinan) dari DNA. Proses
ini berguna untuk memetakan DNA sehingga dapat diketahui dengan pasti DNA dari
satu organisme untuk menentukan genetik keturunannya. Teknik ini biasanya
digunakan untuk mendapatkan atau mengenali DNA dari korban – korban kecelakaan
yang sulit diidentifikasi oleh tim forensik.Bioteknologi adalah cabang ilmu
yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lai-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam
proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan
bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan
yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa.
Beberapa teknologi yang mendasari
Bioteknologi adalah:
1. Teknologi
Antibodi Monoklonal (TAM)
TAM
menggunakan sel-sel sistem imunitas yang disebut antibodi. Dengan mengetahui
cara kerja antibodi, maka kita dapat memanfaatkannya untuk keperluan deteksi,
kuantitasi dan lokalisasi. TAM saat ini telah digunakan untuk deteksi
kehamilan, alat diagnosis berbagai penyakit infeksi dan deteksi sel-sel kanker.
2.
Teknologi Bioproses
Teknologi
bioproses menggunakan sel-sel hidup atau komponen mekanisme biokimia untuk
mensintesis, menguraikan atau membebaskan energi. Termasuk teknologi bioproses
adalah fermentasi dan biodegradasi.
3.
Teknologi Sel dan Kultur Jaringan
Teknologi
sel dan kultur jaringan adalah teknologi yang memungkinkan kita menumbuhkan sel
atau jaringan dalam nutrien yang sesuai di laboratorium. Teknologi ini dapat
dilakukan pada tanaman maupun hewan.
4.
Teknologi Biosensor
Teknologi
biosensor merupakan gabungan antara biologi molekuler dan mikroelektronika.
Teknologi biosensor dapat digunakan dalam berbagai bidang seperti pengukuran
derajat kesegaran suatu bahan pangan, memonitor suatu proses industri, atau
mendeteksi senyawa yang terdapat dalam jumlah kecil di dalam darah.
5.
Rekayasa Genetika
Rekayasa
genetika atau teknologi DNA rekombinan merupakan tulang punggung dan pemicu
lahirnya bioteknologi molekuler. DNA rekombinan dikonstruksi dengan
menggabungkan materi genetik dari dua atau lebih sumber yang berbeda atau
melakukan perubahan secara terarah pada suatu materi genetik tertentu. Rekayasa
genetik merupakan usaha manusia mencari varietas atau galur yang paling sesuai.
6.
Teknologi Rekayasa Protein
Teknologi
rekayasa protein sering digunakan bersamaan dengan rekayasa genetika untuk
meningkatkan profil atau kinerja suatu protein dan untuk mengkonstruksi protein
baru yang secara alami tidak ada. Dengan teknologi rekayasa protein kita dapat
meningkatkan daya katalisis suatu enzim, sehingga dapat lebih produktif pada
kondisi proses-proses industri.
1.2 Tujan
- Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana
- Melihat presipitasi DNA
- Mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate
- Mengetahui cara membuat pohon filogenik yang menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme yang lain
1.3 Manfaat
Manfaat dari dilakukannya praktikum
ini adalah:
- Mahasiswa dapat diketahui bagaimana cara mengekstraksi DNA
- Mahasiswa dapat melihat presipitasi DNA
- Mahasiswa dapat mengidentifikasi kekeraban terdekat dari suatu sekuen DNA
BAB II
Tinjauan Pustaka
2.1 DNA
DNA,
Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks
ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis
dari seluruh bentuk kehidupan sel.
DNA
berbentuk polimer panjang nukleotida, mengkode barisan residu asam amino dalam
protein dengan menggunakan kode genetik, sebuah kode nukleotida triplet.
DNA
seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk
penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia,
ciri-ciri ini misalnya dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit.
Selama pembelahan sel, DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama
reproduksi.
DNA bukanlah
suatu molekul tunggal, nampaknya ia adalah sepasang molekul yang digandeng oleh
ikatan hidrogen: DNA tersusun sebagai untai komplementer dengan ikatan hidrogen
di antara mereka. Masing-masing untai DNA adalah rantai kimia ?batu bata
penyusun?, yakni nukleotida, yang terdiri dari empat tipe: Adenine (A),
Cytosine (C), Guanine (G) dan Thymine (T).
DNA
mengandung informasi genetika yang diwariskan oleh keturunan dari suatu
organisme; informasi ini ditentukan oleh barisan pasangan basa. Sebuah untai
DNA mengandung gen, sebagai cetak biru organisme . DNA membuat genom organisme.
Ternyata DNA
sangat penting , Kalau dalam kepolisiaan proses identifikasi teroris
sangat diperlukan untuk tes DNA, apalagi kalau jasadnya sudah tidak berbentuk
manusia lagi.
DNA adalah
rangkaian molekul penentu bentuk dan sifat semua makhluk hidup. Semua makhluk
hidup punya DNA. Manusia, kucing, monyet, pohon, tomat, pisang, bayam,
dinosaurus. Semua punya kode genetik yang menentukan bentuk dan sifat-sifat
mereka. Jadi kenapa kita terbentuk seperti manusia, atau tumbuhan berbentuk
seperti tumbuhan, atau kenapa kita mirip dengan orangtua kita, dan berbeda
dengan orang lain. Ada orang yang berkulit putih, ada yang sawo matang. Ada
yang rambutnya bule atau berwarna hitam. Semuanya karena kita mempunyai
elemen-elemen pembentuk biologis yang unik, yang namanya molekul DNA itu
DNA adalah
resep, skema, sistematika, manual, peta, cetak biru, rancangan, dan informasi
biologis yang unik dari makhluk hidup. Persis seperti setiap bangunan gedung
yang ada cetak birunya masing-masing. Tidak hanya bentuk fisik makhluk hidup,
tapi juga sifat, lewat keturunan. Jadi sifat manusia bisa terbentuk dari 2 hal:
1. Turunan genetik, lewat DNA dari
orangtua kita.
2. Unsur lingkungan (Michel Peyrard,
2004)
2.2 PCR dan ELEKTROFORESIS
2.2.1 PCR
PCR adalah
suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA
dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang
berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat
kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini
semakin luas penggunaannya.
Pada
dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu
dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer
(annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase
dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim
ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara
mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida
trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang
sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang
beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan
(Brown, 2002).
PCR adalah
proses enzimatik dimana suatu area spesifik dari DNA direplikasikan
berulang-ulang untuk menghasilkan banyak kopi dari sekuen tertentu. Pengkopian
molekuler ini meliputi proses pemanasan dan pendinginan sampel dalam suatu
siklus panas tertentu yang melebihi dari 30 siklus
(http://ariefatoes.wordpress.com/2008/11/07/pcr/)
Komponen dan Tahapan PCR
Penggandaan
urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan
berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi
polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang
akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal
dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa
nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA
polimerase.
DNA templat
adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan
digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence).
Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi
molekul primer.
Primer
adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa.
Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa
dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim
DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap
reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi
(sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq
DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
Tiap putaran
reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan
primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih
kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat
dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap
selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada
dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat.
Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer)
dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA
templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga
ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’
ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian,
pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA
templat awalnya berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan
untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat
pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n
diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n.
Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan
jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang
merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan
(diamplifikasi).
Bisa kita
bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir
reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 – 2.20 =
1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat
awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA
templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas
20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720,
suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.
Perancangan Primer
Tahapan PCR
yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer
oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi
masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung
fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer
atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua
daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum
mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan
cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.
Dasar yang
digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa
sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain
organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk
merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen
lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan
informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens,
P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.
Urutan-urutan
basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan
dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu
strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area).
Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi
urutan basa primer.
Sebenarnya,
daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada
tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA.
Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu
urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu
triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan
kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan
primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran
urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa
pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi
sempurna (100%).
Urutan basa
pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program
komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi
sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology).
Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming),
yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk
mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan
kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai Tm
yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi
(http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/pcr/)
2.3.2
ELEKTROFORESIS
Elektroforesis
adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan
tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada
suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat
digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul,
misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub
ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari
kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung
pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait
dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris
lingkungan:
F adalah
gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA.
Jenis elektroforesis
Perangkat elektroforesis gel.
Elektroforesis
kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam
dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion
kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau
valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit,
kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.
Elektroforesis
gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium
gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar
seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan
menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media
(http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis)
2.3 Blast
Perangkat
bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan pangkalan data sekuens
Biologi ialah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Penelusuran
BLAST (BLAST search) pada pangkalan data sekuens memungkinkan ilmuwan
untuk mencari sekuens baik asam nukleat maupun protein yang mirip dengan
sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen
sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing
atau untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari
kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.
PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) ialah pangkalan data
tunggal yang menyimpan model struktur tiga dimensi protein dan asam nukleat
hasil penentuan eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR,
dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga
dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam protein atau pun asam
nukleat. (Wikipedia
Encyclopedia, 2006).
2.4 Pohon Filogenetik
Pohon
filogenetika atau pohon evolusi adalah diagram percabangan atau “pohon” yang
menunjukkan hubungan evolusi antara berbagai spesies makhluk hidup berdasarkan
kemiripan dan perbedaan karakteristik fisik dan/atau genetik mereka. Takson
yang terhubung pada pohon tersebut berarti diturunkan dari satu nenek moyang
bersama. Penggambaran pertama pohon ini antara lain ditemukan pada buku
Elementary Geology dari Edward Hitchcock (1840) dan The Origin of Species dari
Charles Darwin (1859).
Pohon
filogenetika ini dapat diaplikasikan untuk membuat sistematika biologi, seperti
pohon kehidupan. Selain itu pohon ini dapat digunakan untuk mencari fungsi dari
suatu gen atau protein, riset medis dan epidemiologi seperti HIV, dan studi
evolusi (http://id.wikipedia.org/wiki/Pohon_filogenetika)
Pohon
filogenetik dibuat untuk memvisualisasikan hubungan evolusi diantara berbagai
spesies atau benda-benda lain. Pohon filogenetik yang berupa diagram
bercabang-cabang ini dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan
sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino (protein), pola
pemotongan enzim restriksi, ukuran allel pada analisa microsatellite, dan
lain-lain. Dalam artikel ini kita akan membuat pohon filogenetik berdasarkan
sekuen DNA gen 16S ribosomal RNA dari bakteri-bakteri.
Misalkan
kita mengisolasi bakteri-bakteri yang hidup di permukaan kulit kita, misalnya
ketiak yang kaya akan bakteri golongan Micrococcaceae, kemudian kita
mengisolasi DNA genom bakteri-bakteri tersebut secara langsung dan melakukan
amplifikasi PCR untuk gen 16S rRNA menggunakan primer universal. Produk PCR
tersebut diklon ke plasmid dan setiap klon yang tumbuh dianalisa sekuen DNA
insertnya yang notabene adalah sekuen dari gen 16S rRNA bakteri-bakteri yang
hidup di dalam tanah sampel kita tadi.
Untuk
melihat hubungan kekerabatan antar spesies bakteri yang hidup di permukaan
kulit tersebut, kita bisa mengkonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen
gen 16S rRNA mereka. (http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/aplikasi-molecular-marker-molecular-systematic/)
2.5 Ekstrasi DNA Prokariotik dan Eukariotik
DNA
adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur
perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah:
DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon,
sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak
berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas
memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis
ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan
sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot
berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein
histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan
memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315–316; Raven & Johnson
2002: 94).
DNA
memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan
komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan
pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin
dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki
struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin
(T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan
Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin
berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu
komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu
gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003:
176–178).
Sebuah
sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada
seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang
dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome
Project 2005: 1).
Isolasi
DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat
dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh
maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya
adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah
diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih
kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau
dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada
eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah
sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan
remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi
menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian
disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang
telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA
sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA
yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium
asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl .
Teknik
isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA
vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini
yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada
umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai
bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih
longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi.
Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi
apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi
denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan
kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang
menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid
akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap
oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan
etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada
kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi
kerapatan (http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=26&id=202&artlang=id)
2.6 BioInformatika
Bioinformatika
adalah salah satu cabang baru ilmu biologi yang merupakan perpaduan antara
biologi dan teknologi informasi. Menurut Durso (1997) bioinformatika adalah
manajemen dan analisis informasi biologis yang disimpan dalam database.
Ilmu
ini mengajarkan aplikasi, analisis, dan mengorganisir miliaran bit informasi
genetik dalam sel mahluk hidup. Studi bioinformatika terutama didukung uleh
studi genomik, biologi komputasi, dan teknologi komputer. Menurut Roderick
(lihat Hieter & Boguski, 1997), genomik adalah studi yang berhubungan
dengan pemetaan, sekuen, dan analisis genom. Walaupun belum jelas, secara umum
Genomik bisa diartikan sebagai penggunaan informasi genom secara sistematis,
dengan data eksperimental baru untuk menjawab permasalahan biologis, medis,
maupun industri (Jordan, 1999).
Bioinformatika
sendiri mencakup kajian yang lebih mendalam dari genomik. Dalam studi
bioinformatika digunakan komputer yang mampu menyimpan data dalam jumlah yang
sangat banyak dan didukung berbagai macam software untuk menganalisis jutaan
data yang berasal dari mahluk hidup.
Perkembangan
Bioinformatika
Studi
Bioinformatika mulai tumbuh sebagai akibat dari perkembangan berbagai metode
sekuens baru yang menghasilka data yang sangat banyak. Hal tersebut, secara
kebetulan, didukung pula oleh teknologi penyimpanan, manajemen, dan pertukaran
data melalui komputer. Inovasi dalam pemetaan dan sekuensing memiliki peran
penting dalam proses pengambilan data biologis. Penggunaan Yeast Artificial
Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom kompleks
secara lengkap (Touchmann & Green, 1998). Untuk mengklon fragmen-fragmen
DNA besar (sekitar 150.000 pasangan basa) digunakan bacterial Artificial
Chromosome (BAC).
Kemungkinan,
teknologi yang paling banyak kontribusinya adalah teknologi PCR. Walaupun
tergolong tua (PCR ditemukan tahun 1985), meode ini sangat efektif, dan telah
mengalami penyempurnaan selama bertahun-tahun.
Perkembangan
teknologi sekuensing dimulai dan semi-automatic sequencer yang pertama pada
tahun 1987, dilanjutkan dengan Taq Cycle sequencing pada tahun 1990. Pelabelan
Flourescen fragmen DNA dengan Sanger dideoxy Chain Termination Method,
merupakan dasar bagi proyek sekuensing skala besar (Venter et. al., 199).
Seluruh
perkembangan tersebut sia-sia saja tanpa obyek yang diteliti, yang memiliki
nilai komersil tinggi dan data yang berlimpah. Gampang ditebak, pasti Manusia
melalui Human Genome Project. Selain perkembangan dalam bidang Genomik,
Bioinformatika sangat dipengaruhi oleh perkembangan di bidang teknologi
informasi dan komputer.
Pada
fase awal (sekitar tahun 80-an) perkembangan yang paling signifikan adalah
kapasitas penyimpanan data. Dari hanya baeberapa puluh byte (1980), hingga
mencapai Terabyte (1 terabyte=1 trilyun byte), setelah pembuatan database,
selanjutnya dimulai perkembangan pemuatan perangkat lunak untuk mengolah data.
Awalnya, metode yang digunakan hanya pencariaan kata kunci, dan kalimat pendek.
perkembangan selanjutnya berupa perangkat lunak dengan algoritma yang lebih
kompleks, seperti penyandian nukleotida, menjadi asam-asam amino, kemudian
membuat struktur proteinnya.
Saat
ini, perangkat lunak yang tersedia meliputi pembacaan sekuens nukleotida dari
gel elektroforesis, prediksi kode protein, identifikasi primer, perbandingan
sekuens, analisis kekerabatan, pengenalan pola dan prediksi struktur. Dengan
perkembangan seperti diatas, ternyata masih belum cukup. Kurangnya pemahaman
terhadap sistem biologis dan organisasi molekular membua analisis sekuens masih
mengalami kesulitan. Perbandingan sekuens antar spesies masih sulit akibat
variabilitas DNA. Usaha yang dilakukan saat ini, baru mencoba mempelajari
eori-teori tersebut melalui proses inferensi, penyesuaian model, dan belajar
dari contoh yang tersedia (Baldi & Brunac, 1998).
Perkembangan
perangkat keras komputer juga berperan sangat penting. Kecepatan prosesor,
kapasitas RAM, dan kartu grafik merupakan salah satu pendorong majunya
bioinformatika. Terakhir perkembangan bioinformatika sangat dipengaruhi oleh
pertumbuhan jaringan Internet. Mulai dari e-mail, FTP, Telnet (1980-an),
Gopher, WAIS, hingga ditemukannya World Wide Web oleh Tim Berners-Lee pada
tahun 1990, mendukung kemudahan transfer data yang cepat dan mudah. Saat ini,
telah tersedia sekitar 400 database biologis yang dapat diakses melalui
internet.
Potensi dan
Aplikasi Bioinformatika
Potensi
komersial dari aplikasi bioinformatika sangat menggiurkan. Pada tahun 1998
saja, pangsa pasarnya mencapai sekitar $290 juta, dan diperkirakan akan
mencapai $2 milyar pada tahun 2005. Selama bulan Maret tahun 2000 investasi
pada bidang ini sedikitberkurang. Hal tersebut disebabkan oleh pernyataan
Presiden AS Bill Clinton dan PM Inggris Tony Blair, yang membebaskan akses
terhadap informasi genom manusia sehingga dianggap menghalangi paten terhadap
genom manusia. Tapi, pada akhir bulan, investasi mulai kembali normal karena
bioinformatika masih dianggap cukup prospektif di masa depan.
Menurut
laporan Ventureone di Amerika Serikat pada tahun 2001 dana-dana ventura telah
mencapai $700 juta digunakan untuk pengembangan bioinformatika. Sementara itu,
kepala Divisi Teknologi Khusus untuk Bioinformatika yang pertama di Microsoft
menganggap, ini adalah peluang yang amat besar. Penjualan komputer untuk
ilmuwan-ilmuwan akan mencapai $43 juta.
Beberapa aplikasi
bioinformatika
a.
Transformasi sekuen menjadi
informasi genetik.
Intinya
adalah menjual data, dalam bentuk gen komplit, atau fragmen, yang dapat
digunakan oleh pihak lain untuk mencari potensi terhadap gen tersebut.
b.
Pasien sebagai komoditas
Pasien
dengan kecenderungan terhadap penyakit tertentu dapat diketahui, sehingga mudah
sekali bagi perusahaan oba untuk menawarkan produknya.
c.
Mencari potensi gen
Potensi
dari sebuah gen sangat beragam, bergantung pada ekspresi gen tersebut. Aplikasi
lebih lanjut dapat berupa transgenik, terapi genetik, atau berbagai rekayasa
dan pemanfaatan geneik lainnya.
Permasalahan dan
tantangan yang dihadapi
Perkembangan
yang sedemikian pesat menghasilkan berbagai teknik dan perangkat baru dalam
melakukan manajemen dan analisis data. Karena beragamnya teknik dan perangkat
tersebut, terjadi kesulitan dalam perbandingan, penyimpanan, dan analisis data
dari berbagai platform (Ladd, 2000).
Usaha
standarisasi sedang dilakukan belakangan ini. Salah satu usaha standarisasi
yang paling terkenal adalah BioStandard Project yang dilakukan oleh European
Bioinformatics Institute (Cambridge, UK). Proyek ini didanai oleh European
Bioinformatics Institute, The European Commission, dan beberapa perusahaan
farmasi. Dalam proyek tersebut, dilakukan pengembangan perangkat lunak pengolah
data yang sesuai dengan standar saat ini maupun masa depan (Murray-Rust, 1994).
Selain
standarisasi, bioinformatika juga memiliki masalah lain, yaitu pengolahan data.
Saat ini, data yang berhasil dikumpulkan saat ini, sehingga membutuhkan waktu
yang sangat lama untuk dianalisis. Data dasar yang diperoleh dari data genomik
hanya berupa sekumpulan simbol A, G, T, dan C yang jumlahnya mencapai milyaran
bahkan trilyunan. Kesulitannya adalah bagaimana merubah simbol tersebut menjadi
-misalnya- gen penyakit asma. Proses menganalisis data genomik menjadi
informasi yang dapat dimengerti biasa disebut Data Mining. Dalam proses Data
Mining digunakan teknologi pengenalan pola (Pattern Recognition Technology) dan
analisis statistika untuk mengolah data dalam jumlah 2banyak (Wedin, 1999).
Tujuan dari Data mining adalah untuk mencari korelasi baru, pola, dan trend.
Permasalahan
lain pun muncul menghadang. Sebagai disiplin ilmu yang baru terbentuk, bioinformatika
kekurangan SDM yang kompeten. Hal tersebut dijelaskan oleh Craig Benham,
seorang Profesor pada sekolah kedokteran Mount Sinai di New York. Ia mengajar
bioinformatika aplikasi teknologi informasi. Seperti dijelaskan Benham, ia pada
tahun 2000-2001 tidak memiliki murid di program pasca sarjananya. Padahal,
diprediksikan bidang ini membutuhkan sekitar 20.000 tenaga kerja terlatih yang
kompeten dalam bidang biologi sekaligus ilmu komputer
(http://fahrezamaulana.blogspot.com/2011/03/perkembangan-bioteknologi.html)
2.7 Sequencing DNA
Analisa
DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap
rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life scienceyang
melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini
adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para
peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam
melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA
sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada
laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang
penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA
Sequencing.
Sequencing
menggunakan Dye Primers
Ketika menggunakan
sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah.
Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dyefluorescent yang
berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang
dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi
berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat
dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak,
menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena
digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang
diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk
terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan
dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer
Sequencing
menggunakan Dye Terminators
DNA
sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia
dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung
reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi
untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan
dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat
jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase
ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent
terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP
yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warnadye
yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung
sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya
(http://annisainayatims.blog.uns.ac.id/2010/11/15/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/).
BAB III
MATERI DAN METODE
3.1. WAKTU DAN TEMPAT
Hari/ tanggal : Jumat, 6 April 2012
Waktu
: 10.00 – selesai
Tempat
: Laboratorium Terpadu
3.2. ALAT DAN BAHAN
3.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA Eukariotik
(Strawbery)
Alat dan Bahan :
|
Nama Alat
|
Fungsi
|
|
1.Tabung sentrifugase 50 ml
|
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel
dengan larutan dan melihat DNA
strawberry yang di dapat
|
|
2. Baker glass
|
Untuk mengukur cairan yang akan di remas
|
|
3. Plastik Zip-lock
|
Untuk tempat stawberry yang akan diremas
|
|
4. Saringan
|
Untuk meletakkan larutan juice strawberry
serta bahan lainnya.
|
|
5. Tabung sentrifuge
|
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel
dengan larutan dan melihat DNA strawberry yang di dapat.
|
|
Nama Bahan
|
Fungsi
|
|
1. 95% Alkohol (ice cold)
|
Sebagai campuran untuk menghomogenkan
larutan.
|
|
2. Stawberry
|
Untuk bahan visualisai Pengambilan DNA
|
|
3. Lysis buffer
|
Untuk memecah sel DNA
|
|
4. Garam iodium
|
Untuk bahan visualisasi pengambilan DNA
|
|
5. Aquades
|
Untuk Campuran larutan lysis buffer
|
|
6. Enzim
|
Untuk mempercepat proses visualisasi DNA
|
|
7. Shampo
|
Untuk
memisahkan DNA pada strawberry.
|
3.2.2. Visualisasi Ekstraksi DNA Eukariotik (Pisang)
Alat dan Bahan :
|
Nama Alat
|
Fungsi
|
|
1.Tabung sentrifugase 50 ml
|
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel
dengan larutan dan melihat DNA
strawberry yang di dapat
|
|
2. Baker glass
|
Untuk mengukur cairan yang akan di remas
|
|
3. Plastik Zip-lock
|
Untuk tempat stawberry yang akan diremas
|
|
4. Saringan
|
Untuk meletakkan larutan juice strawberry
serta bahan lainnya.
|
|
5. Tabung sentrifuge
|
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel
dengan larutan dan melihat DNA strawberry yang di dapat.
|
|
Nama Bahan
|
Fungsi
|
|
1. 95% Alkohol (ice cold)
|
Sebagai campuran untuk menghomogenkan larutan.
|
|
2. Pisang
|
Untuk bahan visualisai Pengambilan DNA
|
|
3. Lysis buffer
|
Untuk memecah sel DNA
|
|
4. Garam iodium
|
Untuk bahan visualisasi pengambilan DNA
|
|
5. Aquades
|
Untuk Campuran larutan lysis buffer
|
|
6. Enzim
|
Untuk mempercepat proses visualisasi DNA
|
|
7. Shampo
|
Untuk
memisahkan DNA pada strawberry.
|
3.2.3. Analisis sequen DNA dengan Blast
Alat dan Bahan:
|
Nama Alat
|
Fungsi
|
|
1. Komputer / laptop
|
Sebagai media untuk menghubungkan keinternet
dan untuk mengolah data yang diperoleh.
|
|
2. Jaringan internet
|
Untuk dihubungkan ke computer serta sequen DNA
|
|
Nama Bahan
|
Fungsi
|
|
1. Hasil
sequen DNA
|
Untuk
mengetahui hasil sequen
|
3.2.4 Pengolahan data hasil identifikasi sekuen dengan
menggunakan program bioinformatika
Alat dan
Bahan:
|
Nama Alat
|
Fungsi
|
|
1. Komputer / laptop
|
Sebagai media untuk menghubungkan keinternet
dan untuk mengolah data yang diperoleh.
|
|
2. Softwere ClustalX dan NJ plot
|
Untuk pengolahan data sequen DNA
|
|
Nama Bahan
|
Fungsi
|
|
1. Hasil –
hasil sekuen
|
Untuk
hasil dari data
|
3.3.
Metodelogi
3.3.1.
Visualisasi Ekstraksi DNA
3.3.1.1.
Isolasi DNA Prokariot
1.
Dalam kondidi aseptis,
isi tabung apendorf 1,5 ml dengan aquadest
2.
Kemudian ambil 1 ose
kultur bakteri dan inokulasikan kedalam tabung apendorf tersebut
3.
Suspense bakteri
tersebut kemudian dimasukkan kedalam freezer
4.
Diamkan hingga
mengkristal
5.
Sementara itu panaskan
air hingga suhu air mencapai 900C
6.
Sementara itu suspense
mengkristal, rendam tabung apendorf di air selama 10 menit
7.
Ulangi langkah diatas
sebanyak tiga kali
3.3.1.2.
Isolasi DNA Eukariot
- Ambil 1 buah strawberry, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.
- Letakkan sebagian strawberry kedalam plastic ziplock dan remas-remas dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice.
- Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam plastic dan tutup kembali.
- Lanjutkan meremas plastic kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/ homogeny dengan larutan juice
- Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit
- Buang saringan dan ekstrak yang ada
- Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi strawberi dan larutan.
- Tuangkan sebanyak 10 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml. Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya
9.
Amati perubahan dan
goyang perlahan hingga DNA terlihat naik.
dan diamati sampai terlihat DNA mulai presipitasi
sampai beberapa saat
1.
Setelah computer
dihidupkan, aktifkan sambungan internet
3.
Click nucleotide blast
4.
Enter query sequen dengan
cara copy/paste
5.
Kemudian setelah semua
perintah dilengkapi click submit
6.
Tunggu beberapa saat
7.
hasil identifikasi sekuen bisa diamati.
Catat hasilnya.
3.3.3.
Pengolahan Data hasil identifikasi sekuen Menggunakan Program BioInformatika
1.
Simpan data nukleotida
bakteri yang akan diolah dalam bentuk txt
2.
Buka program ClustalX
kemudian pilih File kemudian Load
3.
Pilih file LBT sekuen
Topan
4.
Kemudian pilih
Allignment dilanjutkan Do Complete Allignment
5.
Pilih Tree kemudian
ceklish exclude
6.
Kemudian Klik boot
strap dan draw N-J tree. data akan tersimpan dalam bentuk phb, ph dan dnd
7.
Selanjutnya buka
program N-J plot
8.
Buka ketiga data yang
tersimpan dalam format phb, dengan open with dan select program, pilih aplikasi
Mega3, lalu ok
9.
Setelah data tampil
dilanjutkan dengan klik Display Only Topology
BAB IV
PEMBAHASAN
4.1.
Hasil
4.1.1.
Visualisasi Ekstraksi DNA
Pada
praktikum visualisasi ekstraksi dari DNA ini didapatkan hasil dari isolasi
genom DNA diantaranya yaitu:
a.
Isolasi DNA Prokariot
Pada
isolasi DNA prokariot didapatkan dari
sampel DNA, dengan suspense mengkristal setelah dimasukkan kedalam freezer dan
mencair kembali setelah dipanaskan sampai akhirnya mendapatkan DNA yang
berwarna putih.
b.
Isolasi DNA Eukariot
Pada
isolasi DNA eukariot didapatkan hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol
dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna bening dan berupa benang – benang
putih.
c.
Hasil gambar Isolasi
DNA Prokariot
4.1.2.
Analisis sequen DNA dengan Blast
4.1.3.
Pengolahan Data hasil identifikasi sekuen Menggunakan Program BioInformatika
4.2
Pembahasan
4.2.1.
Visualisasi Ekstraksi DNA
Pada
ekstraksi suatu DNA, yaitu isolasi DNA prokariot. materi genetik dan berfungsi
untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.
Dilihat dari organismenya, DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan
berbentuk sirkular. Karena
ukuran relatif kecil genom prokariotik, banyak urutan genom lengkap untuk
berbagai bakteri dan archaea telah dipublikasikan selama beberapa tahun
terakhir. Akibatnya, kita mulai mengerti banyak tentang anatomi genom
prokariotik, dan dalam banyak hal kita tahu lebih banyak tentang organisme
daripada kita tentang eukariota. Dari hasil elektroforesis
menunjukkan pita DNA tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak),
sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kemungkinan hal itu disebabkan
adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada
saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA ini kita mendapatkan DNA yang belum
benar-benar murni.
Ada 5
tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan
membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap
pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel
bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan
larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyai
membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang membentuk penghalang memisahkan
isi sel dari lingkungan ekstraseluler. pada DNA terdapat didalam suatu sel
sehingga untuk emngisolasi dari suatu DNA, harus dilakukan pemecahan sel secara
fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical
destruption, liquid homozigation, sonofikasi, freeze dan manual grinding.
Pada DNA eukariot menggunakan strawberry
dan Pisang untuk dilihat DNAnya. Strawberry dan Pisang diremas-remas dengan
tujuan agar mendapatkan ekstrak DNA dari buah tersebut. Penambahan buffer lysis
pada remasan strawberry, bertujuan untuk memisahkan lemak dan protein yang
terkandung dalam strawberry, sifat dari buffer lysis ini tidak merusak DNA. Sedangkan
penggunaan shampoo untuk memecahkan dinding sel DNA. Setelah penambahan buffer
lysis, larutan disaring/filter agar didapatkan ekstrak/sari strawberry
(terpisah dengan serat strawberrynya). Kemudian dilakukan dengan menambah 95%
alkohol dingin untuk memunculkan DNAnya (memperjelas visualisasi DNA).
Pada hasil praktikum ini, setelah
penambahan 95% alkohol muncul DNAnya. Yaitu antara ekstrak strawberry, Pisang
dan larutan 95% alkohol terpisah, dan akan muncul DNA (presipitasi) yang naik
ke atas (pada bagian alkohol).
4.2.2 Analisis Sequen DNA dengan Blast
Analisis sequen DNA dengan blast bertujuan
untuk mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate dengan cara
membaca kode-kode DNA dalam bentuk digital. Analisis sekuen ini dilakukan untuk
mengetahui karakteristik dari fragmen DNA seperti peta restriksi, rangka baca,
kodon awal, kodon akhir,dan tempat promoternya. Analisis sequen DNA ini
menggunakan blast untuk mencari kesamaan yang didesain untuk mengeksplorasi
semua database sekuen yang diminta, baik itu berupa DNA atau protein. Juga
untuk mendeteksi hubungan di antara sekuen yang hanya berbagi daerah tertentu
yang memiliki kesamaan.
4.2.3 Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sekuen
Menggunakan Program BioInformatika
Setelah didapatkan
hasil sekuen, kemudian sekuen DNA tersebut dibuat dengan menggunaka program
ClustalX. Pada proses identifikasi DNA dengan
menggunakan progam bioinformatika ini untuk menentukan atau mengetahui dari
tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu mikroorganisme. Dari sini akan dihasilkan pohon filogenetik,
yang bertujuan untuk membandingkan dari hasi sekuensing yang didapat pada
sekuensing DNA.
Dari hasil draw N-J
Tree (phb), sekuen DNA LBT sekuen Topan lebih identik
(tingkat kekerabatannya lebih dekat) dengan jenis
bakteri
Paenibacillus lautus
strain, Paenibacillus sp dan masih banyak yang
mempunyai tingkat kekerabatan terdekat antar suatu bakteri.
Hubungan yang dekat
ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut berevolusi dari nenek moyang yang sama
(van Berkum et al., 1995).
Dari hasil identifikasi bakteri yang
didapat dengan menggunakan progam bioinformatika, sumber dari bakteri tersebut
rata – rata berasal dari tanah, plastic. Ini merupakan dari karakteristik dari
suatu organism yang didapat dengan Paenibacillus darangshiensis partial, Uncultured compost bacterium partial,
Paenibacillus lactis strain ZYb1, Paenibacillus lautus
strain, Paenibacillus sp.
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari praktikum dasar – dasar bioteknologi kali ini
dapat diambil beberapakesimpulan yang diantaranya yaitu:
- DNA merupakan suatu polimer besar dengan property karakteristik fisik yang unik dan yang ditemukan pada Tahun 1869 Oleh Johann Friedrich Miescher.
- Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino.
- Analisa DNA sequencing sangat penting untuk mengetahui genetik kehidupan.
- BLAST merupakan alat bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengansekuens tertentu yang dimilikinya dan algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.
5.2 Saran
- Ke depannya asisten tetap ramah dan bersahabat dengan praktikan jadi komunikasi antara asisten dan praktikan lancar.
- Pengenalan akan peranan dan manfaat praktikum belum sepenuhnya dimengerti.
DAFTAR PUSATAKA
Artama, W.T. 1991. Rekayasa
Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta
Lehninger, A.L. 1982. Dasar
– dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta
Michel Peyrard, Nonlinear
Dynamics and Statistical Physics of DNA, 2004
Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa
Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta
http://annisainayatims.blog.uns.ac.id/2010/11/15/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/(diakses pada 26 April 2012 20.43
pm)
http://ariefatoes.wordpress.com/2008/11/07/pcr/
(diakses pada 26 April 2012 20.49 pm WIB)
http://cyber-biology.blogspot.com/2009/06/Bioteknologi.html (diakses tanggal 26 April 2012 pukul: 20.35 pm WIB)
http://fahrezamaulana.blogspot.com/2011/03/perkembangan-bioteknologi.html
(diakses pada 26 April 2012 21.10 pm
WIB)
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/aplikasi-molecular-marker-molecular-systematic/
(diakses pada 26 April 2012 21.25 pm
WIB).
http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=26&id=202&artlang=id
(diakses pada 26 2012 April 21.22 pm WIB)
http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis
(diakses pada 26 April 2012 21.02 pm WIB)
Download Laporan : http://www.indowebster.com/laporan_dasbio_topan_fix_print_.html
Tidak ada komentar:
Posting Komentar