Senin, 07 Mei 2012

Laporan Dasar-Dasar Bioteknologi


LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM DASAR-DASAR BIOTEKNOLOGI

“VISUALISASI EKSTRAKSI DNA, ANALISIS SEQUEN DNA DENGAN BLAST DAN PENGOLAHAN DATA HASIL IDENTIFIKASI SEQUEN MENGGUNAKKAN PROGRAM BIOINFORMATIKA”



TOPAN EKA PRASTYA
26020110110002
IK - A



PROGRAM STUDI ILMU KELAUTAN
JURUSAN ILMU KELAUTAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
2012


BAB I
PENDAHALUAN
1.1 Latar Belakang
1.1.1 Pengertian Bioteknologi
Bioteknologi berasal dari dua kata, yaitu ‘bio’ yang berarti makhuk hidup dan ‘teknologi’ yang berarti cara untuk memproduksi barang. Dengan definisi tersebut bioteknologi bukan merupakan sesuatu yang baru. Nenek moyang kita telah memanfaatkan mikroba untuk membuat produk-produk berguna seperti tempe, oncom, tape, arak, terasi, kecap, yogurt, dan nata de coco .Hampir semua antibiotik berasal dari mikroba, demikian pula enzim-enzim yang dipakai untuk membuat sirop fruktosa hingga pencuci pakaian.
Bioteknologi adalah penggunaan biokimia, mikrobiologi, dan rekayasa genetika secara terpadu, untuk menghasilkan barang atau lainnya bagi kepentingan manusia.Biokimia mempelajari struktur kimiawi organisme. Rekayasa genetika adalah aplikasi genetik dengan mentransplantasi gen dari satu organisme ke organisme lain.
Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa (Sumber : Wikipedia).
Menurut Jujun Ratnasari, S.Si., M.Si., bioteknologi adalah manipulasi organisme atau komponen organisme tersebut untuk melakukan tugas praktis, menghasilkan produk yang bermanfaat. Sejak berabad-abad bioteknologi yang menggunakan mikroorganisme telah berlangsung secara tradisional, seperti pada proses pembuatan anggur, bir, keju, sake, dan lain-lain. Proses tradisional ini hanya menggunakan dan mengandalkan proses genetik alami dari mikroba.
Bioteknologi merupakan suatu usaha terpadu dari berbagain disiplin ilmu untuk mengolah bahan baku dengan memanfaatkan mikroorganisme dan komponen-komponen lainnyauntuk menghasilkan barang dan jasa. Disiplin ilmu yang terlibat dalam bioteknologi, di antaranya Kimia, Biokimia, Rekayasa Biokimia, Teknik Kimia, Mikrobiologi, dan tentunya Biologi.
Menurut Yuwono (2006 : 1), bioteknologi memiliki pengertian penerapan prinsip-prinsip biologi, biokimia, dan rekayasa dalam pengolahan bahan dengan memanfaatkan agensia jasad hidup dan komponen-komponennya untuk menghasilkan barang dan jasa. Dengan melihat pengertian tersebut, semua produk atau jasa yang berasal dari jasad hidup atau komponennya dan yang dihasilkan dari penerapan teknik biologi, biokimia, dan rekayasa adalah produk atau jasa bioteknologi.
Dalam batasan pengertian bioteknologi, ada beberapa ciri dari suatu proses bioteknologi. Ciri-ciri tersebut sebagai berikut.
  1. Adanya agen biologi yang dipergunakan. Agen biologi yang dipergunakan ini tidak hanya dalam bentuk fisik yang dipanen, namun juga termasuk di dalamnya adalah hasil metabolit sekunder atau enzim yang dihasilkan.
  2. Penggunaan agen biologi dilakukan dengan suatu cara atau metode tertentu.
  3. Adanya produk turunan atau jasa yang dipakai dari proses pengguaan agen biologi tersebut.
Suatu proses industri bioteknologi yang menggunakan mikroorganisme untuk menghasilkan suatu produk, pada dasarnya terdiri dari tiga tahap utama yaitu:
1.      Proses hulu dimana melibatkan serangkaian perlakuan pada bahan mentah sehingga dapat digunakan sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme sasaran.
2.      Fermentasi dan transformasi adalah pertumbuhan mikroorganisme sasaran dalam bioreaktor besar yang diikuti dengan produksi bahan yang diinginkan, misalnya antibiotik, asam amino, enzim, atau asam-asam organik
3.      Proses hilir adalah proses pemurnian senyawa atau bahan yang diinginkan dari medium fermentasi atau dari massa sel.

1.1.2 Prinsip-prinsip Dasar Bioteknologi
Ada beberapa proses yang merupakan prinsip dasar dari bioteknologi, yaitu fermentasi, seleksi dan persilangan, analisa genetik, kultur jaringan, rekombinasi DNA, dan analisa DNA.

1. Fermentasi
Fermentasi adalah proses produksi energi dalam sel dalam keadaan anaerobik (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk respirasi anaerobik, akan tetapi, terdapat definisi yang lebih jelas yang mendefinisikan fermentasi sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik dengan tanpa akseptor elektron eksternal.
Fermentasi merupakan proses dasar untuk mengubah suatu bahan menjadi bahan lain dengan cara sederhana dan dibantu oleh mikroorganisme. Proses fermentasi ini merupakan bioteknologi sederhana dan sudah dikenal sejak jaman dahulu. Contohnya pembutan roti, minuman anggur, yoghurt, tuak dan sake.

2. Seleksi dan Persilangan
Proses seleksi dilakukan dengan memenipulasi DNA yang ada pada mikroba, tanaman, atau hewan agar menjadi mikroba, tanaman, atau hewan dengan sifat yang lebih baik sehingga apabila disilangkan akan menjadi bibit unggul yang baik untuk masa depan. Contohnya, ayam Leghorn, sapi ayrshire, padi Cisadane kedelai Muria, dan jagung Metro.

3. Analisa Genetik
Proses ini mempelajari cirri atau sifat dan gen makhluk hidup dari generasi ke generasi untuk mendapatkan sifat atau ciri yang unggul serta interaksi antara gen dan lingkungan agr menghasilkan keturunan yang baik.    

4. Kultur Jaringan

Kultur jaringan atau biakan jaringan merupakan teknik pemeliharaan jaringan atau bagian dari individu secara buatan (artifisial). Yang dimaksud secara buatan adalah dilakukan di luar individu yang bersangkutan. Karena itu teknik ini sering kali disebut kultur in vitro, sebagai lawan dari in vivo. Dikatakan in vitro (bahasa Latin, berarti "di dalam kaca") karena jaringan dibiakkan di dalam tabung inkubasi atau cawan Petri dari kaca atau material tembus pandang lainnya. Kultur jaringan secara teoretis dapat dilakukan untuk semua jaringan, baik dari tumbuhan maupun hewan (termasuk manusia) namun masing-masing jaringan memerlukan komposisi media tertentu.
Selain itu, kultur jaringan diartikan juga sebagai proses menumbuhkan atau memperbanyak jaringan hewan dan tanaman dari jaringan atau selnya di dalam laboratorium tanpa mendapat gangguan dari organisme lain. Proses ini dimanfaatkan untuk perbanyakan, produksi bahan-bahan kimia, dan riset di bidang pengobatan. Contohnya kultur jaringan anggrek dan pisang.
Pelaksanaan teknik ini memerlukan berbagai prasyarat untuk mendukung kehidupan jaringan yang dibiakkan. Yang paling esensial adalah wadah dan media tumbuh yang steril. Media adalah tempat bagi jaringan untuk tumbuh dan mengambil nutrisi yang mendukung kehidupan jaringan. Media tumbuh menyediakan berbagai bahan yang diperlukan jaringan untuk hidup dan memperbanyak dirinya. Ada dua penggolongan media tumbuh: media padat dan media cair. Media padat pada umumnya berupa padatan gel, seperti agar. Nutrisi dicampurkan pada agar. Media cair adalah nutrisi yang dilarutkan di air. Media cair dapat bersifat tenang atau dalam kondisi selalu bergerak, tergantung kebutuhan.
Teori dasar dari kultur in vitro ini adalah Totipotensi.Teori ini mempercayai bahwa setiap bagian tanaman dapat berkebang biak, karena seluruh bagian tanaman terdiri atas jaringan - jaringan hidup.
Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah
  1. Pembuatan media
  2. Inisiasi
  3. Sterilisasi
  4. Multiplikasi
  5. Pengakaran
  6. Aklimatisasi
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.  Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.  Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.  Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca.  Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf.
Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas. 
Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril. Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan.  Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.  
Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan.  Tabung reaksi yang telah ditanami ekplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.
Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik.  Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri). 
Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. 

5. Rekombinasi DNA

Proses transfer segmen DNA dari satu organisme ke DNA organisme lain dinamakan rekombinasi DNA. Kedua organisme itu dapat saja tidak memiliki hubungan atau kekerabatan.Contohnya, penyisipan gen manusia pada bakteri Bacillus thuringiensis sehingga bakteri tersebut dapat memproduksi insulin.
Rekombinasi merupakan hasil teknologi atau rekombinasi DNA di laboratorium.Dengan teknologi DNA dapat diproduksi atau dibuat fragmen DNA tertentu.Enzim digunakan untuk memotong fragmen DNA dan menempelkan fragmen DNA ke tempat yang diinginkan.Enzim restriksi digunakan untuk memotong fragmen DNA menjadi fragmen-fragmen.Sementara enzim DNA ligase menyambungkan antar fragmen DNA.Dengan pemotongan dan penyambungan kembali bagian yang diinginkan dapat didesain urutan DNA sesuai kode yang diinginkan atau gen yang diinginkan.
Gen dapat diklon dalam plasmid rekombinan, plasmid buatan hasil rekombinasi.Plasmid adalah DNA sirkuler yang dimiliki bakteri dapat bereplikasi dan diturunkan ketika sel bakteri membelah. Plasmid diartikan juga sebagai salah satu vektor atau pembawa rekombinan gen atau rekombinan DNA. Gen yang telah diklon dapat disimpan dalam pustaka genom berupa plasmid rekombinan atau virus DNA rekombinan. Enzim reverse transcriptase dapat membuat DNA dari RNA dan kemudian DNA hasilnya dapat diklon.Molekul probe atau molekul penanda dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen khusus yang dibawa suatu DNA (gen) klon. Ada alat otomatik untuk membuat proses sintesa DNA yang cepat dan mensekuens urutan DNA.
Metoda untuk menganalisa fragmen DNA hasil kerja enzim restriksi dan mendeteksi perbedaan fragmen yang dihasilkan telah ada Metode PCR dapat memperbanyak sampel DNA yang dituju.Rekayasa genetika pada sel bakteria, yeast, tanaman, hewan digunakan untuk menghasilkan produk gen secara massal.Kelebihan teknologi DNA atau rekayasa genetika menjadi penyebab revolusi pada industri farmasi dan pengobatan manusia, bidang pertanian, dan rekayasa genetika sudah sangat akrab, hewan transgenik dan pengembangan riset masa kini.Kekurangan teknologi DNA membawa risiko, menimbulkan pertanyaan etika yang penting.

6. Analisis DNA

Proses reaksi rantai polymerase sehingga dapat membuat kopi (salinan) dari DNA. Proses ini berguna untuk memetakan DNA sehingga dapat diketahui dengan pasti DNA dari satu organisme untuk menentukan genetik keturunannya. Teknik ini biasanya digunakan untuk mendapatkan atau mengenali DNA dari korban – korban kecelakaan yang sulit diidentifikasi oleh tim forensik.Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, fungi, virus, dan lai-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya. Dengan kata lain, bioteknologi adalah ilmu terapan yang menggabungkan berbagai cabang ilmu dalam proses produksi barang dan jasa.

Beberapa teknologi yang mendasari Bioteknologi adalah:
1.      Teknologi Antibodi Monoklonal (TAM)
TAM menggunakan sel-sel sistem imunitas yang disebut antibodi. Dengan mengetahui cara kerja antibodi, maka kita dapat memanfaatkannya untuk keperluan deteksi, kuantitasi dan lokalisasi. TAM saat ini telah digunakan untuk deteksi kehamilan, alat diagnosis berbagai penyakit infeksi dan deteksi sel-sel kanker.
2.      Teknologi Bioproses
Teknologi bioproses menggunakan sel-sel hidup atau komponen mekanisme biokimia untuk mensintesis, menguraikan atau membebaskan energi. Termasuk teknologi bioproses adalah fermentasi dan biodegradasi.
3.      Teknologi Sel dan Kultur Jaringan
Teknologi sel dan kultur jaringan adalah teknologi yang memungkinkan kita menumbuhkan sel atau jaringan dalam nutrien yang sesuai di laboratorium. Teknologi ini dapat dilakukan pada tanaman maupun hewan.
4.      Teknologi Biosensor
Teknologi biosensor merupakan gabungan antara biologi molekuler dan mikroelektronika. Teknologi biosensor dapat digunakan dalam berbagai bidang seperti pengukuran derajat kesegaran suatu bahan pangan, memonitor suatu proses industri, atau mendeteksi senyawa yang terdapat dalam jumlah kecil di dalam darah.
5.      Rekayasa Genetika
Rekayasa genetika atau teknologi DNA rekombinan merupakan tulang punggung dan pemicu lahirnya bioteknologi molekuler. DNA rekombinan dikonstruksi dengan menggabungkan materi genetik dari dua atau lebih sumber yang berbeda atau melakukan perubahan secara terarah pada suatu materi genetik tertentu. Rekayasa genetik merupakan usaha manusia mencari varietas atau galur yang paling sesuai.

6.      Teknologi Rekayasa Protein
Teknologi rekayasa protein sering digunakan bersamaan dengan rekayasa genetika untuk meningkatkan profil atau kinerja suatu protein dan untuk mengkonstruksi protein baru yang secara alami tidak ada. Dengan teknologi rekayasa protein kita dapat meningkatkan daya katalisis suatu enzim, sehingga dapat lebih produktif pada kondisi proses-proses industri.
1.2 Tujan
  1. Mengetahui cara mengekstraksi DNA secara sederhana
  2. Melihat presipitasi DNA
  3. Mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate
  4. Mengetahui cara membuat pohon filogenik yang menunjukkan tingkat kekerabatan terdekat dengan mikroorganisme yang lain
1.3 Manfaat
Manfaat dari dilakukannya praktikum ini adalah:
  1. Mahasiswa dapat diketahui bagaimana cara mengekstraksi DNA
  2. Mahasiswa dapat melihat presipitasi DNA
  3. Mahasiswa dapat mengidentifikasi kekeraban terdekat dari suatu sekuen DNA







BAB II
Tinjauan Pustaka
2.1 DNA
DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel.
DNA berbentuk polimer panjang nukleotida, mengkode barisan residu asam amino dalam protein dengan menggunakan kode genetik, sebuah kode nukleotida triplet.
DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab untuk penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan. Pada manusia, ciri-ciri ini misalnya dari warna rambut hingga kerentanan terhadap penyakit. Selama pembelahan sel, DNA direplikasi dan dapat diteruskan ke keturunan selama reproduksi.
DNA bukanlah suatu molekul tunggal, nampaknya ia adalah sepasang molekul yang digandeng oleh ikatan hidrogen: DNA tersusun sebagai untai komplementer dengan ikatan hidrogen di antara mereka. Masing-masing untai DNA adalah rantai kimia ?batu bata penyusun?, yakni nukleotida, yang terdiri dari empat tipe: Adenine (A), Cytosine (C), Guanine (G) dan Thymine (T).
DNA mengandung informasi genetika yang diwariskan oleh keturunan dari suatu organisme; informasi ini ditentukan oleh barisan pasangan basa. Sebuah untai DNA mengandung gen, sebagai cetak biru organisme . DNA membuat genom organisme.
Ternyata DNA sangat penting , Kalau dalam  kepolisiaan proses identifikasi teroris sangat diperlukan untuk tes DNA, apalagi kalau jasadnya sudah tidak berbentuk manusia lagi.
DNA adalah rangkaian molekul penentu bentuk dan sifat semua makhluk hidup. Semua makhluk hidup punya DNA. Manusia, kucing, monyet, pohon, tomat, pisang, bayam, dinosaurus. Semua punya kode genetik yang menentukan bentuk dan sifat-sifat mereka. Jadi kenapa kita terbentuk seperti manusia, atau tumbuhan berbentuk seperti tumbuhan, atau kenapa kita mirip dengan orangtua kita, dan berbeda dengan orang lain. Ada orang yang berkulit putih, ada yang sawo matang. Ada yang rambutnya bule atau berwarna hitam. Semuanya karena kita mempunyai elemen-elemen pembentuk biologis yang unik, yang namanya molekul DNA itu
DNA adalah resep, skema, sistematika, manual, peta, cetak biru, rancangan, dan informasi biologis yang unik dari makhluk hidup. Persis seperti setiap bangunan gedung yang ada cetak birunya masing-masing. Tidak hanya bentuk fisik makhluk hidup, tapi juga sifat, lewat keturunan. Jadi sifat manusia bisa terbentuk dari 2 hal:
1. Turunan genetik, lewat DNA dari orangtua kita.
2. Unsur lingkungan (Michel Peyrard, 2004)
2.2  PCR dan ELEKTROFORESIS
2.2.1 PCR
PCR adalah suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA. Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuens DNA yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya.
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang diinginkan (Brown, 2002).
PCR adalah proses enzimatik dimana suatu area spesifik dari DNA direplikasikan berulang-ulang untuk menghasilkan banyak kopi dari sekuen tertentu. Pengkopian molekuler ini meliputi proses pemanasan dan pendinginan sampel dalam suatu siklus panas tertentu yang melebihi dari 30 siklus (http://ariefatoes.wordpress.com/2008/11/07/pcr/)
Komponen dan Tahapan PCR
Penggandaan urutan basa nukleotida berlangsung melalui reaksi polimerisasi yang dilakukan berulang-ulang secara berantai selama beberapa putaran (siklus). Tiap reaksi polimerisasi membutuhkan komponen-komponen sintesis DNA seperti untai DNA yang akan digunakan sebagai cetakan (templat), molekul oligonukleotida untai tunggal dengan ujung 3’-OH bebas yang berfungsi sebagai prekursor (primer), sumber basa nukleotida berupa empat macam dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), dan enzim DNA polimerase.
DNA templat adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence). Penggandaan urutan target pada dasarnya merupakan akumulasi hasil polimerisasi molekul primer.
Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (sekitar 95ºC). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.
Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi templat, penempelan primer, dan polimerisasi primer, yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95ºC, 50ºC, dan 70ºC. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli oleh primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA.
Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).
Bisa kita bayangkan seandainya PCR dilakukan dalam 20 putaran saja, maka pada akhir reaksi akan diperoleh fragmen urutan target sebanyak 220 – 2.20 = 1.048576 – 40 = 1.048536 ! Jumlah ini masih dengan asumsi bahwa DNA templat awalnya hanya satu untai ganda. Padahal kenyataannya, hampir tidak mungkin DNA templat awal hanya berupa satu untai ganda. Jika DNA templat awal terdiri atas 20 untai ganda saja, maka jumlah tadi tinggal dikalikan 20 menjadi 20.970.720, suatu jumlah yang sangat cukup bila akan digunakan sebagai fragmen pelacak.
Perancangan Primer
Tahapan PCR yang paling menentukan adalah penempelan primer. Sepasang primer oligonukleotida (primer maju dan primer mundur) yang akan dipolimerisasi masing-masing harus menempel pada sekuens target, tepatnya pada kedua ujung fragmen yang akan diamplifikasi. Untuk itu urutan basanya harus komplementer atau setidak-tidaknya memiliki homologi cukup tinggi dengan urutan basa kedua daerah ujung fragmen yang akan diamplifikasi itu. Padahal, kita belum mengetahui dengan pasti urutan basa sekuens target. Oleh karena itu, diperlukan cara tertentu untuk merancang urutan basa kedua primer yang akan digunakan.
Dasar yang digunakan adalah urutan basa yang diduga mempunyai kemiripan dengan urutan basa sekuens target. Urutan ini adalah urutan serupa dari sejumlah spesies/strain organisme lainnya yang telah diketahui/dipublikasikan. Sebagai contoh, untuk merancang sepasang primer yang diharapkan dapat mengamplifikasi sebagian gen lipase pada isolat Bacillus termofilik tertentu dapat digunakan informasi urutan basa gen lipase dari strain-strain Pseudomonas fluorescens, P. mendocina , dan sebagainya, yang sebelumnya telah diketahui.
Urutan-urutan basa fragmen tertentu dari berbagai strain tersebut kemudian dijajarkan dan dicari satu daerah atau lebih yang memperlihatkan homologi tinggi antara satu strain dan lainnya. Daerah ini dinamakan daerah lestari (conserved area). Sebagian/seluruh urutan basa pada daerah lestari inilah yang akan menjadi urutan basa primer.
Sebenarnya, daerah lestari juga dapat ditentukan melalui penjajaran urutan asam amino pada tingkat protein. Urutan asam amino ini kemudian diturunkan ke urutan basa DNA. Dari satu urutan asam amino sangat mungkin akan diperoleh lebih dari satu urutan basa DNA karena setiap asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu triplet kodon. Dengan demikian, urutan basa primer yang disusun dapat merupakan kombinasi beberapa kemungkinan. Primer dengan urutan basa semacam ini dinamakan primer degenerate. Selain itu, primer yang disusun melalui penjajaran urutan basa DNA pun dapat merupakan primer degenerate karena urutan basa pada daerah lestari di tingkat DNA pun tidak selamanya memperlihatkan homologi sempurna (100%).
Urutan basa pasangan primer yang telah disusun kemudian dianalisis menggunakan program komputer untuk mengetahui kemungkinan terjadinya primer-dimer akibat homologi sendiri (self-homology) atau homologi silang (cross-homology). Selain itu, juga perlu dilihat kemungkinan terjadinya salah tempel (mispriming), yaitu penempelan primer di luar sekuens target. Analisis juga dilakukan untuk mengetahui titik leleh (Tm) masing-masing primer dan kandungan GC-nya. Sepasang primer yang baik harus mempunyai Tm yang relatif sama dengan kandungan GC yang cukup tinggi (http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/pcr/)
2.3.2 ELEKTROFORESIS
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

Jenis elektroforesis
Perangkat elektroforesis gel.
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media (http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis)
2.3  Blast
Perangkat bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan pangkalan data sekuens Biologi ialah BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Penelusuran BLAST (BLAST search) pada pangkalan data sekuens memungkinkan ilmuwan untuk mencari sekuens baik asam nukleat maupun protein yang mirip dengan sekuens tertentu yang dimilikinya. Hal ini berguna misalnya untuk menemukan gen sejenis pada beberapa organisme atau untuk memeriksa keabsahan hasil sekuensing atau untuk memeriksa fungsi gen hasil sekuensing. Algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.
PDB (Protein Data Bank, Bank Data Protein) ialah pangkalan data tunggal yang menyimpan model struktur tiga dimensi protein dan asam nukleat hasil penentuan eksperimental (dengan kristalografi sinar-X, spektroskopi NMR, dan mikroskopi elektron). PDB menyimpan data struktur sebagai koordinat tiga dimensi yang menggambarkan posisi atom-atom dalam protein atau pun asam nukleat. (Wikipedia Encyclopedia, 2006).
2.4  Pohon Filogenetik
Pohon filogenetika atau pohon evolusi adalah diagram percabangan atau “pohon” yang menunjukkan hubungan evolusi antara berbagai spesies makhluk hidup berdasarkan kemiripan dan perbedaan karakteristik fisik dan/atau genetik mereka. Takson yang terhubung pada pohon tersebut berarti diturunkan dari satu nenek moyang bersama. Penggambaran pertama pohon ini antara lain ditemukan pada buku Elementary Geology dari Edward Hitchcock (1840) dan The Origin of Species dari Charles Darwin (1859).
Pohon filogenetika ini dapat diaplikasikan untuk membuat sistematika biologi, seperti pohon kehidupan. Selain itu pohon ini dapat digunakan untuk mencari fungsi dari suatu gen atau protein, riset medis dan epidemiologi seperti HIV, dan studi evolusi (http://id.wikipedia.org/wiki/Pohon_filogenetika)
Pohon filogenetik dibuat untuk memvisualisasikan hubungan evolusi diantara berbagai spesies atau benda-benda lain. Pohon filogenetik yang berupa diagram bercabang-cabang ini dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik atau genetik seperti sekuen DNA, sekuen asam amino (protein), pola pemotongan enzim restriksi, ukuran allel pada analisa microsatellite, dan lain-lain. Dalam artikel ini kita akan membuat pohon filogenetik berdasarkan sekuen DNA gen 16S ribosomal RNA dari bakteri-bakteri.
Misalkan kita mengisolasi bakteri-bakteri yang hidup di permukaan kulit kita, misalnya ketiak yang kaya akan bakteri golongan Micrococcaceae, kemudian kita mengisolasi DNA genom bakteri-bakteri tersebut secara langsung dan melakukan amplifikasi PCR untuk gen 16S rRNA menggunakan primer universal. Produk PCR tersebut diklon ke plasmid dan setiap klon yang tumbuh dianalisa sekuen DNA insertnya yang notabene adalah sekuen dari gen 16S rRNA bakteri-bakteri yang hidup di dalam tanah sampel kita tadi.
Untuk melihat hubungan kekerabatan antar spesies bakteri yang hidup di permukaan kulit tersebut, kita bisa mengkonstruksi pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA mereka. (http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/aplikasi-molecular-marker-molecular-systematic/)     
2.5  Ekstrasi DNA Prokariotik dan Eukariotik
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315–316; Raven & Johnson 2002: 94).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176–178).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1).
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl .
Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.
Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan (http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=26&id=202&artlang=id)
2.6  BioInformatika
Bioinformatika adalah salah satu cabang baru ilmu biologi yang merupakan perpaduan antara biologi dan teknologi informasi. Menurut Durso (1997) bioinformatika adalah manajemen dan analisis informasi biologis yang disimpan dalam database.
Ilmu ini mengajarkan aplikasi, analisis, dan mengorganisir miliaran bit informasi genetik dalam sel mahluk hidup. Studi bioinformatika terutama didukung uleh studi genomik, biologi komputasi, dan teknologi komputer. Menurut Roderick (lihat Hieter & Boguski, 1997), genomik adalah studi yang berhubungan dengan pemetaan, sekuen, dan analisis genom. Walaupun belum jelas, secara umum Genomik bisa diartikan sebagai penggunaan informasi genom secara sistematis, dengan data eksperimental baru untuk menjawab permasalahan biologis, medis, maupun industri (Jordan, 1999).
Bioinformatika sendiri mencakup kajian yang lebih mendalam dari genomik. Dalam studi bioinformatika digunakan komputer yang mampu menyimpan data dalam jumlah yang sangat banyak dan didukung berbagai macam software untuk menganalisis jutaan data yang berasal dari mahluk hidup.
Perkembangan Bioinformatika
Studi Bioinformatika mulai tumbuh sebagai akibat dari perkembangan berbagai metode sekuens baru yang menghasilka data yang sangat banyak. Hal tersebut, secara kebetulan, didukung pula oleh teknologi penyimpanan, manajemen, dan pertukaran data melalui komputer. Inovasi dalam pemetaan dan sekuensing memiliki peran penting dalam proses pengambilan data biologis. Penggunaan Yeast Artificial Chromosome (YAC), sangat membantu dalam konstruksi peta fisik genom kompleks secara lengkap (Touchmann & Green, 1998). Untuk mengklon fragmen-fragmen DNA besar (sekitar 150.000 pasangan basa) digunakan bacterial Artificial Chromosome (BAC).
Kemungkinan, teknologi yang paling banyak kontribusinya adalah teknologi PCR. Walaupun tergolong tua (PCR ditemukan tahun 1985), meode ini sangat efektif, dan telah mengalami penyempurnaan selama bertahun-tahun.
Perkembangan teknologi sekuensing dimulai dan semi-automatic sequencer yang pertama pada tahun 1987, dilanjutkan dengan Taq Cycle sequencing pada tahun 1990. Pelabelan Flourescen fragmen DNA dengan Sanger dideoxy Chain Termination Method, merupakan dasar bagi proyek sekuensing skala besar (Venter et. al., 199).
Seluruh perkembangan tersebut sia-sia saja tanpa obyek yang diteliti, yang memiliki nilai komersil tinggi dan data yang berlimpah. Gampang ditebak, pasti Manusia melalui Human Genome Project. Selain perkembangan dalam bidang Genomik, Bioinformatika sangat dipengaruhi oleh perkembangan di bidang teknologi informasi dan komputer.
Pada fase awal (sekitar tahun 80-an) perkembangan yang paling signifikan adalah kapasitas penyimpanan data. Dari hanya baeberapa puluh byte (1980), hingga mencapai Terabyte (1 terabyte=1 trilyun byte), setelah pembuatan database, selanjutnya dimulai perkembangan pemuatan perangkat lunak untuk mengolah data. Awalnya, metode yang digunakan hanya pencariaan kata kunci, dan kalimat pendek. perkembangan selanjutnya berupa perangkat lunak dengan algoritma yang lebih kompleks, seperti penyandian nukleotida, menjadi asam-asam amino, kemudian membuat struktur proteinnya.
Saat ini, perangkat lunak yang tersedia meliputi pembacaan sekuens nukleotida dari gel elektroforesis, prediksi kode protein, identifikasi primer, perbandingan sekuens, analisis kekerabatan, pengenalan pola dan prediksi struktur. Dengan perkembangan seperti diatas, ternyata masih belum cukup. Kurangnya pemahaman terhadap sistem biologis dan organisasi molekular membua analisis sekuens masih mengalami kesulitan. Perbandingan sekuens antar spesies masih sulit akibat variabilitas DNA. Usaha yang dilakukan saat ini, baru mencoba mempelajari eori-teori tersebut melalui proses inferensi, penyesuaian model, dan belajar dari contoh yang tersedia (Baldi & Brunac, 1998).
Perkembangan perangkat keras komputer juga berperan sangat penting. Kecepatan prosesor, kapasitas RAM, dan kartu grafik merupakan salah satu pendorong majunya bioinformatika. Terakhir perkembangan bioinformatika sangat dipengaruhi oleh pertumbuhan jaringan Internet. Mulai dari e-mail, FTP, Telnet (1980-an), Gopher, WAIS, hingga ditemukannya World Wide Web oleh Tim Berners-Lee pada tahun 1990, mendukung kemudahan transfer data yang cepat dan mudah. Saat ini, telah tersedia sekitar 400 database biologis yang dapat diakses melalui internet.
Potensi dan Aplikasi Bioinformatika
Potensi komersial dari aplikasi bioinformatika sangat menggiurkan. Pada tahun 1998 saja, pangsa pasarnya mencapai sekitar $290 juta, dan diperkirakan akan mencapai $2 milyar pada tahun 2005. Selama bulan Maret tahun 2000 investasi pada bidang ini sedikitberkurang. Hal tersebut disebabkan oleh pernyataan Presiden AS Bill Clinton dan PM Inggris Tony Blair, yang membebaskan akses terhadap informasi genom manusia sehingga dianggap menghalangi paten terhadap genom manusia. Tapi, pada akhir bulan, investasi mulai kembali normal karena bioinformatika masih dianggap cukup prospektif di masa depan.
Menurut laporan Ventureone di Amerika Serikat pada tahun 2001 dana-dana ventura telah mencapai $700 juta digunakan untuk pengembangan bioinformatika. Sementara itu, kepala Divisi Teknologi Khusus untuk Bioinformatika yang pertama di Microsoft menganggap, ini adalah peluang yang amat besar. Penjualan komputer untuk ilmuwan-ilmuwan akan mencapai $43 juta.
Beberapa aplikasi bioinformatika
a.       Transformasi sekuen menjadi informasi genetik.
Intinya adalah menjual data, dalam bentuk gen komplit, atau fragmen, yang dapat digunakan oleh pihak lain untuk mencari potensi terhadap gen tersebut.
b.      Pasien sebagai komoditas
Pasien dengan kecenderungan terhadap penyakit tertentu dapat diketahui, sehingga mudah sekali bagi perusahaan oba untuk menawarkan produknya.
c.       Mencari potensi gen
Potensi dari sebuah gen sangat beragam, bergantung pada ekspresi gen tersebut. Aplikasi lebih lanjut dapat berupa transgenik, terapi genetik, atau berbagai rekayasa dan pemanfaatan geneik lainnya.
Permasalahan dan tantangan yang dihadapi
Perkembangan yang sedemikian pesat menghasilkan berbagai teknik dan perangkat baru dalam melakukan manajemen dan analisis data. Karena beragamnya teknik dan perangkat tersebut, terjadi kesulitan dalam perbandingan, penyimpanan, dan analisis data dari berbagai platform (Ladd, 2000).
Usaha standarisasi sedang dilakukan belakangan ini. Salah satu usaha standarisasi yang paling terkenal adalah BioStandard Project yang dilakukan oleh European Bioinformatics Institute (Cambridge, UK). Proyek ini didanai oleh European Bioinformatics Institute, The European Commission, dan beberapa perusahaan farmasi. Dalam proyek tersebut, dilakukan pengembangan perangkat lunak pengolah data yang sesuai dengan standar saat ini maupun masa depan (Murray-Rust, 1994).
Selain standarisasi, bioinformatika juga memiliki masalah lain, yaitu pengolahan data. Saat ini, data yang berhasil dikumpulkan saat ini, sehingga membutuhkan waktu yang sangat lama untuk dianalisis. Data dasar yang diperoleh dari data genomik hanya berupa sekumpulan simbol A, G, T, dan C yang jumlahnya mencapai milyaran bahkan trilyunan. Kesulitannya adalah bagaimana merubah simbol tersebut menjadi -misalnya- gen penyakit asma. Proses menganalisis data genomik menjadi informasi yang dapat dimengerti biasa disebut Data Mining. Dalam proses Data Mining digunakan teknologi pengenalan pola (Pattern Recognition Technology) dan analisis statistika untuk mengolah data dalam jumlah 2banyak (Wedin, 1999). Tujuan dari Data mining adalah untuk mencari korelasi baru, pola, dan trend.
Permasalahan lain pun muncul menghadang. Sebagai disiplin ilmu yang baru terbentuk, bioinformatika kekurangan SDM yang kompeten. Hal tersebut dijelaskan oleh Craig Benham, seorang Profesor pada sekolah kedokteran Mount Sinai di New York. Ia mengajar bioinformatika aplikasi teknologi informasi. Seperti dijelaskan Benham, ia pada tahun 2000-2001 tidak memiliki murid di program pasca sarjananya. Padahal, diprediksikan bidang ini membutuhkan sekitar 20.000 tenaga kerja terlatih yang kompeten dalam bidang biologi sekaligus ilmu komputer (http://fahrezamaulana.blogspot.com/2011/03/perkembangan-bioteknologi.html)

2.7 Sequencing DNA
Analisa DNA sequencing merupakan salah satu tools yang sangat penting dalam mengungkap rahasia genetik di balik kehidupan. Banyak sekali penelitian life scienceyang melibatkan analisa ini. Pencapaian terbesar teknologi DNA sequencing saat ini adalah terungkapnya urutan basa nukleotida yang menyusun genom manusia. Para peneliti yang menggunakan tools ini seringkali menghadapi masalah dalam melakukan analisa, output yang dihasilkan seringkali tidak memuaskan. DNA sequencing menggunakan elektrophoresis kapiler merupakan teknologi kunci pada laboratorium-laboratorium life science. Berikut ini adalah beberapa hal yang penting untuk diketahui yang menjadi faktor penentu keberhasilan analisa DNA Sequencing.
Sequencing menggunakan Dye Primers
Ketika menggunakan sequencing chemistry berbasis dye primer, dilakukan empat reaksi terpisah. Setiap reaksi dilabel pada ujung 5′-nya dengan menggunakan dyefluorescent yang berbeda. Masing-masing keempat reaksi ini akan mengandung apakah primer yang dilabel warna biru, hijau, kuning atau merah. Warna setiap reaksi berkorespondensi dengan A, C, G atau T. Dideoksiribonukleotida (ddNTP) terdapat dalam setiap campuran reaksi, dan menterminasi sintesis DNA secara acak, menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Karena digunakan primer yang dilabel fluorescent untuk ekstensi, seluruh fragmen yang diterminasi terlabel fluorescent. Setelah beberapa siklus yang cukup untuk terbentuknya produk ekstensi yang optimal, keempat reaksi tersebut digabungkan dan dielektroforesis menggunakan satu kapiler pada mesin Genetic Analyzer
Sequencing menggunakan Dye Terminators
DNA sequencing fluorescent dapat juga dilakukan menggunakan suatu bahan kimia dimana pewarna (dye) terikat pada ddNTP, sehingga membutuhkan hanya satu tabung reaksi per sample, bukan empat. Karena hanya membutuhkan satu tabung reaksi untuk reaksi dye terminator, bahan kimia ini lebih simple untuk digunakan dibanding dye primer chemistry. Template DNA, primer tak dilabel, buffer, empat jenis dNTP, empat jenis ddNTP yang terlabel fluorescent, dan DNA polymerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Fragmen-fragmen yang berfluorescent terbentuk karena inkorporasi ddNTP yang terlabel pewarna. Masing-masing ddNTP yang berbeda (ddATP, ddCTP, ddGTP, atau ddTTP) akan membawa sebuah warnadye yang berbeda. Dengan demikian semua fragmen yang diterminasi (yang berujung sebuah ddNTP), mengandung sebuah dye pada ujung 3′-nya (http://annisainayatims.blog.uns.ac.id/2010/11/15/faktor-penentu-keberhasilan-analisa-dna-sequencing/).  

















BAB III  
MATERI DAN METODE

3.1. WAKTU DAN TEMPAT
Hari/ tanggal : Jumat, 6 April 2012
Waktu           : 10.00 – selesai
Tempat         : Laboratorium Terpadu
3.2. ALAT DAN BAHAN
3.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA Eukariotik (Strawbery)
Alat dan Bahan :
Nama Alat
Fungsi
1.Tabung sentrifugase 50 ml
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel dengan   larutan dan melihat DNA strawberry yang di dapat
2. Baker glass
Untuk mengukur cairan yang akan di remas
3. Plastik Zip-lock
Untuk tempat stawberry yang akan diremas
4. Saringan
Untuk meletakkan larutan juice strawberry serta bahan lainnya.
5. Tabung sentrifuge
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel dengan larutan dan melihat DNA strawberry yang di dapat.
Nama Bahan
Fungsi
1. 95% Alkohol (ice cold)
Sebagai campuran untuk menghomogenkan larutan.
2. Stawberry
Untuk bahan visualisai Pengambilan DNA
3. Lysis buffer
Untuk memecah sel DNA
4. Garam iodium
Untuk bahan visualisasi pengambilan DNA
5. Aquades
Untuk Campuran larutan lysis buffer
6. Enzim
Untuk mempercepat proses visualisasi DNA
7. Shampo
Untuk memisahkan DNA pada strawberry.

3.2.2. Visualisasi Ekstraksi DNA Eukariotik (Pisang)
Alat dan Bahan :
Nama Alat
Fungsi
1.Tabung sentrifugase 50 ml
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel dengan   larutan dan melihat DNA strawberry yang di dapat
2. Baker glass
Untuk mengukur cairan yang akan di remas
3. Plastik Zip-lock
Untuk tempat stawberry yang akan diremas
4. Saringan
Untuk meletakkan larutan juice strawberry serta bahan lainnya.
5. Tabung sentrifuge
Untuk tempat sampel dan mencampurkan sampel dengan larutan dan melihat DNA strawberry yang di dapat.
Nama Bahan
Fungsi
1. 95% Alkohol (ice cold)
Sebagai campuran untuk menghomogenkan larutan.
2. Pisang
Untuk bahan visualisai Pengambilan DNA
3. Lysis buffer
Untuk memecah sel DNA
4. Garam iodium
Untuk bahan visualisasi pengambilan DNA
5. Aquades
Untuk Campuran larutan lysis buffer
6. Enzim
Untuk mempercepat proses visualisasi DNA
7. Shampo
Untuk memisahkan DNA pada strawberry.
3.2.3. Analisis sequen DNA dengan Blast
Alat dan Bahan:
Nama Alat
Fungsi
1. Komputer / laptop
Sebagai media untuk menghubungkan keinternet dan untuk mengolah data yang diperoleh.
2. Jaringan internet
Untuk dihubungkan ke computer serta sequen DNA
Nama Bahan
Fungsi
1. Hasil sequen DNA
Untuk mengetahui hasil sequen

3.2.4 Pengolahan data hasil identifikasi sekuen dengan menggunakan program bioinformatika
Alat dan Bahan:
Nama Alat
Fungsi
1. Komputer / laptop
Sebagai media untuk menghubungkan keinternet dan untuk mengolah data yang diperoleh.
2. Softwere ClustalX dan NJ plot
Untuk pengolahan data sequen DNA
Nama Bahan
Fungsi
1. Hasil – hasil sekuen
Untuk hasil dari data

3.3. Metodelogi
3.3.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
3.3.1.1. Isolasi DNA Prokariot
1.      Dalam kondidi aseptis, isi tabung apendorf 1,5 ml dengan aquadest
2.      Kemudian ambil 1 ose kultur bakteri dan inokulasikan kedalam tabung apendorf tersebut
3.      Suspense bakteri tersebut kemudian dimasukkan kedalam freezer
4.      Diamkan hingga mengkristal
5.      Sementara itu panaskan air hingga suhu air mencapai 900C
6.      Sementara itu suspense mengkristal, rendam tabung apendorf di air selama 10 menit
7.      Ulangi langkah diatas sebanyak tiga kali

3.3.1.2. Isolasi DNA Eukariot
  1. Ambil 1 buah strawberry, kemudian dibelah / dibagi menjadi 2 bagian.
  2. Letakkan sebagian strawberry kedalam plastic ziplock dan remas-remas dengan jari tangan hingga menjadi cairan juice.
  3. Tambahkan 10 ml buffer lisis kedalam plastic dan tutup kembali.
  4. Lanjutkan meremas plastic kurang lebih 2-3 menit hingga bercampur/ homogeny dengan larutan juice
  5. Kemudian larutan disaring/filter dan biarkan selama 10 menit
  6. Buang saringan dan ekstrak yang ada
  7. Teteskan sebanyak 2-4 tetes enzim ke dalam tabung yang telah berisi strawberi dan larutan.
  8. Tuangkan sebanyak 10 ml 95 % alcohol dingin ke dalam tabung sentrifuge 50 ml. Lalu tuangkan larutan yang telah disaring kedalam tabung, tutup tabungnya
9.      Amati perubahan dan goyang perlahan hingga DNA terlihat naik.
dan diamati sampai terlihat DNA mulai presipitasi sampai beberapa saat
1.      Setelah computer dihidupkan, aktifkan sambungan internet
2.      Cari Web BLAST www.ncbi.nlm.nih.gov./Blast.cgi




3.      Click nucleotide blast
4.      Enter query sequen dengan cara copy/paste

5.      Kemudian setelah semua perintah dilengkapi click submit
6.      Tunggu beberapa saat

7.       hasil identifikasi sekuen bisa diamati.
            Catat hasilnya.


3.3.3. Pengolahan Data hasil identifikasi sekuen Menggunakan Program BioInformatika
1.      Simpan data nukleotida bakteri yang akan diolah dalam bentuk txt

2.      Buka program ClustalX kemudian pilih File kemudian Load

3.      Pilih file LBT sekuen Topan

4.      Kemudian pilih Allignment dilanjutkan Do Complete Allignment


5.      Pilih Tree kemudian ceklish exclude

6.      Kemudian Klik boot strap dan draw N-J tree. data akan tersimpan dalam bentuk phb, ph dan dnd



7.      Selanjutnya buka program N-J plot




8.      Buka ketiga data yang tersimpan dalam format phb, dengan open with dan select program, pilih aplikasi Mega3, lalu ok


9.      Setelah data tampil dilanjutkan dengan klik Display Only Topology



BAB IV
 PEMBAHASAN
4.1. Hasil
4.1.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
Pada praktikum visualisasi ekstraksi dari DNA ini didapatkan hasil dari isolasi genom DNA  diantaranya yaitu:
a.       Isolasi DNA Prokariot
Pada isolasi DNA prokariot didapatkan  dari sampel DNA, dengan suspense mengkristal setelah dimasukkan kedalam freezer dan mencair kembali setelah dipanaskan sampai akhirnya mendapatkan DNA yang berwarna putih.
b.      Isolasi DNA Eukariot
Pada isolasi DNA eukariot didapatkan hasil, DNA naik keatas setelah diberi alcohol dengan warna dari DNA itu sendiri berwarna bening dan berupa benang – benang putih.
c.       Hasil gambar Isolasi DNA Prokariot

4.1.2. Analisis sequen DNA dengan Blast

4.1.3. Pengolahan Data hasil identifikasi sekuen Menggunakan Program BioInformatika


4.2 Pembahasan
4.2.1. Visualisasi Ekstraksi DNA
Pada ekstraksi suatu DNA, yaitu isolasi DNA prokariot. materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Dilihat dari organismenya, DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular. Karena ukuran relatif kecil genom prokariotik, banyak urutan genom lengkap untuk berbagai bakteri dan archaea telah dipublikasikan selama beberapa tahun terakhir. Akibatnya, kita mulai mengerti banyak tentang anatomi genom prokariotik, dan dalam banyak hal kita tahu lebih banyak tentang organisme daripada kita tentang eukariota. Dari hasil elektroforesis menunjukkan pita DNA tampak jelas (berarti jumlah DNA yang terdeteksi banyak), sedangkan bagian bawah gel agarose masih terdapat berkas. Kemungkinan hal itu disebabkan adanya protein lain atau ada bagian-bagian sel yang terikut (debris sel) pada saat isolasi DNA. Jadi pada isolasi DNA ini kita mendapatkan DNA yang belum benar-benar murni.
Ada 5 tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu: isolasi sel, pelisisan dinding dan membran sel, pengekstraksian dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi sel yang ingin digunakan, yaitu sel bakteri. Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis sel. Pada isolasi dari genom DNA ini semua sel mempunyai membrane plasma, lapisan lipoprotein ganda yang membentuk penghalang memisahkan isi sel dari lingkungan ekstraseluler. pada DNA terdapat didalam suatu sel sehingga untuk emngisolasi dari suatu DNA, harus dilakukan pemecahan sel secara fisik yang diantaranya yaitu seperti mechanical destruption, liquid homozigation, sonofikasi, freeze dan manual grinding.
Pada DNA eukariot menggunakan strawberry dan Pisang untuk dilihat DNAnya. Strawberry dan Pisang diremas-remas dengan tujuan agar mendapatkan ekstrak DNA dari buah tersebut. Penambahan buffer lysis pada remasan strawberry, bertujuan untuk memisahkan lemak dan protein yang terkandung dalam strawberry, sifat dari buffer lysis ini tidak merusak DNA. Sedangkan penggunaan shampoo untuk memecahkan dinding sel DNA. Setelah penambahan buffer lysis, larutan disaring/filter agar didapatkan ekstrak/sari strawberry (terpisah dengan serat strawberrynya). Kemudian dilakukan dengan menambah 95% alkohol dingin untuk memunculkan DNAnya (memperjelas visualisasi DNA).
Pada hasil praktikum ini, setelah penambahan 95% alkohol muncul DNAnya. Yaitu antara ekstrak strawberry, Pisang dan larutan 95% alkohol terpisah, dan akan muncul DNA (presipitasi) yang naik ke atas (pada bagian alkohol).

 4.2.2 Analisis Sequen DNA dengan Blast
Analisis sequen DNA dengan blast bertujuan untuk mengidentifikasi kekerabatan terdekat sekuen DNA isolate dengan cara membaca kode-kode DNA dalam bentuk digital. Analisis sekuen ini dilakukan untuk mengetahui karakteristik dari fragmen DNA seperti peta restriksi, rangka baca, kodon awal, kodon akhir,dan tempat promoternya. Analisis sequen DNA ini menggunakan blast untuk mencari kesamaan yang didesain untuk mengeksplorasi semua database sekuen yang diminta, baik itu berupa DNA atau protein. Juga untuk mendeteksi hubungan di antara sekuen yang hanya berbagi daerah tertentu yang memiliki kesamaan.
4.2.3 Pengolahan Data Hasil Identifikasi Sekuen Menggunakan Program BioInformatika
Setelah didapatkan hasil sekuen, kemudian sekuen DNA tersebut dibuat dengan menggunaka program ClustalX. Pada proses identifikasi DNA dengan menggunakan progam bioinformatika ini untuk menentukan atau mengetahui dari tingkat hubungan dari kekerabatan dari suatu mikroorganisme. Dari sini akan dihasilkan pohon filogenetik, yang bertujuan untuk membandingkan dari hasi sekuensing yang didapat pada sekuensing DNA.
Dari hasil draw N-J Tree (phb), sekuen DNA LBT sekuen Topan  lebih identik (tingkat kekerabatannya lebih dekat) dengan jenis bakteri
Paenibacillus lautus strain, Paenibacillus sp dan masih banyak yang mempunyai tingkat kekerabatan terdekat antar suatu bakteri.
Hubungan yang dekat ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut berevolusi dari nenek moyang yang sama (van Berkum et al., 1995).
Dari hasil identifikasi bakteri yang didapat dengan menggunakan progam bioinformatika, sumber dari bakteri tersebut rata – rata berasal dari tanah, plastic. Ini merupakan dari karakteristik dari suatu organism yang didapat  dengan Paenibacillus darangshiensis partial, Uncultured compost bacterium partial, Paenibacillus lactis strain ZYb1, Paenibacillus lautus strain, Paenibacillus sp.













BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1  Kesimpulan
Dari praktikum dasar – dasar bioteknologi kali ini dapat diambil beberapakesimpulan yang diantaranya yaitu:
  1. DNA merupakan suatu polimer besar dengan property karakteristik fisik yang unik dan yang ditemukan pada Tahun 1869 Oleh Johann Friedrich Miescher.
  2. Bioinformatika adalah ilmu yang mempelajari penerapan tekhnik komputasional untuk mengelola dan menganalisis informasi biologi. Bidang ini mencakup penerapan metode-metode matematika, statiska, dan informatika untuk memecahkan masalah-masalah biologis, terutama dengan menggunakan sekuens DNA dan asam amino.
  3. Analisa DNA sequencing sangat penting untuk mengetahui genetik kehidupan.
  4. BLAST merupakan alat bioinformatika yang berkaitan erat dengan penggunaan basis data sekuens biologis. Penelusuran BLAST untuk mencari sekuens asam nukleat maupun protein yang mirip dengansekuens tertentu yang dimilikinya dan algoritma yang mendasari kerja BLAST adalah penyejajaran sekuens.
5.2  Saran
  1. Ke depannya asisten tetap ramah dan bersahabat dengan praktikan jadi komunikasi antara asisten dan praktikan lancar.
  2. Pengenalan akan peranan dan manfaat praktikum belum sepenuhnya dimengerti.

DAFTAR PUSATAKA
Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi. UGM. Yogyakarta
Lehninger,  A.L. 1982. Dasar – dasar Biokimia. jilid 1. Penerbit Erlangga. Jakarta
Michel Peyrard, Nonlinear Dynamics and Statistical Physics of DNA, 2004
Mubarika, Sofia. 1990. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi UGM. Yogyakarta
http://ariefatoes.wordpress.com/2008/11/07/pcr/ (diakses pada 26 April 2012 20.49 pm WIB)
http://cyber-biology.blogspot.com/2009/06/Bioteknologi.html (diakses tanggal 26 April 2012 pukul: 20.35 pm WIB)
http://fahrezamaulana.blogspot.com/2011/03/perkembangan-bioteknologi.html (diakses pada 26 April 2012  21.10 pm WIB)
http://www.fp.unud.ac.id/biotek/analisis-molekuler/aplikasi-molecular-marker-molecular-systematic/ (diakses pada 26 April 2012 21.25  pm WIB).
http://ruangilmu.com/index.php?action=artikel&cat=26&id=202&artlang=id (diakses pada 26 2012 April 21.22 pm WIB)
http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis (diakses pada 26 April 2012 21.02 pm WIB)

 Download Laporan : http://www.indowebster.com/laporan_dasbio_topan_fix_print_.html